蝴蝶兰叶肉细胞原生质体分离及融合条件研究
以蝴蝶兰无菌苗幼嫩叶片为材料，采用正交试验设计，比较了不同酶液配比、渗透压、酶解时间、纯化方法以及不同品种对蝴蝶兰原生质体分离的影响，并探讨了PEG处理对蝴蝶兰原生质体融合的影响。结果表明在相同条件下，酶液成分为1.0%的纤维素酶，0.7%离析酶，0.4M甘露醇，酶解6h，并用21%蔗糖溶液纯化后，所得有活力的原生质体产量最高，产量可达6.50×106g-1(FW)，不同蝴蝶兰品种间无显著差异。原生质体融合适宜条件为采用浓度为35%的PEG-6000溶液处理20min时，原生质体融合效果最好，融合率达35.93%。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 原生质体分离 2
1．1．1 试验材料 2
1．1．2 主要仪器用品 2
1．1．3 化学试剂 2
1．1．4 分离方法 2
1．2 原生质体纯化 3
1．2．1 试验材料 3
1．2．2 纯化方法 3
1．3 原生质体产量测定 3
1．3．1 试验材料 3
1．3．2 测定方法 3
1．4 原生质体活力测定 3
1．4．1 试验材料 3
1．4．2 测定方法 3
1．5 原生质体融合 3
1．5．1 试验材料 4
1．5．2 化学试剂 4
1．5．3 融合方法 4
2 结果与分析 4
2．1 蝴蝶兰叶肉细胞原生质体分离条件研究 4
2．1．1 不同酶液组合及酶解时间对蝴蝶兰原生质体分离的影响 4
2．1．2 原生质体纯化条件 5
2．1．3 不同蝴蝶兰品种原生质体分离效果比较 6
2．2 蝴蝶兰叶肉细胞原生质体融合条件研究 6
2．2．1 PEG种类对蝴蝶兰原生质体融合的影响 6
2．2．2 PEG浓度对蝴蝶兰原生质体融合的影响 6
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
/> 2．2．3 PEG处理时间对蝴蝶兰原生质体融合的影响 7
3 讨论 8
3．1 蝴蝶兰叶肉细胞原生质体分离材料 8
3．2 蝴蝶兰叶肉细胞原生质体分离方法 8
3．3 蝴蝶兰叶肉细胞原生质体融合条件 8
致谢 9
参考文献 9
蝴蝶兰叶肉细胞原生质体分离及融合条件研究
引言
蝴蝶兰属于兰科蝴蝶兰属（Phalaenopsis），因其花期长、花色丰富、花姿优雅而得到了广泛栽培，受到了大众的喜爱，素有“洋兰皇后”之称[1]。
蝴蝶兰属于单轴性兰[2]，不能像国兰、石斛兰那样分株繁殖，而无菌播种繁殖也难以保证品种的纯度，因此的繁殖方法比较单一，一般采用组织培养的方式进行。目前蝴蝶兰存在品种更新速度慢，连续继代后性状逐渐退化的问题。分离纯化蝴蝶兰原生质体，并将不同品种蝴蝶兰原生质体进行融合和培养，可以获得体细胞杂种植株，缩短育种周期，对于改良蝴蝶兰品种具有重要的意义。此外，以原生质体为受体，可以进行外源基因的转移，因此原生质体培养技术也是开展蝴蝶兰基因工程研究的有效手段。
为建立高效、稳定的蝴蝶兰原生质体培养技术体系，本试验以不同品种蝴蝶兰无菌苗的叶片为材料，进行原生质体分离及融合条件研究，以期为蝴蝶兰体细胞杂交及基因转移等工作提供技术基础。
1 材料与方法
1．1 原生质体分离
1．1．1 试验材料
以蝴蝶兰黄花品种‘CQY’和红花品种‘780’无菌苗为材料，利用蝴蝶兰生长培养基对其进行连续继代，以获得幼嫩的无菌苗叶片，用于原生质体的分离。蝴蝶兰生长培养基以MS培养基为基本培养基，添加100 ml/L的椰汁，pH为5.6。
1．1．2 主要仪器用品
恒温摇床（上海新苗QYC2102C）、立式压力蒸汽灭菌器（BOXUN）、光学显微镜（Leica DM1000）、荧光显微镜（OLYMPUS BX53）、低速离心机（湘仪L500）、pH计（METTLER TOLEDO）、血球计数板、三角瓶、培养皿、200目筛网、移液器等。
1．1．3 化学试剂
（1）0.4、0.5、0.6M等不同浓度甘露醇溶液；
（2）CPW溶液（表1）；
表1 CPW溶液所含成分（pH5.6）
Table 1 Components of CPW（pH5.6）
成分
含量(mg/L)
KH2PO4
27.200
KNO3
101.000
CaCl2.2H2O
1480.000
MgSO4
246.000
KI
0.160
CuSO4.5H2O
0.025
MES
1000.000
（3）洗液：CPW溶液中添加9%甘露醇；
（4）悬浮液：CPW溶液中添加21%~25%蔗糖；
（5）酶液：10ml甘露醇（浓度为0.4、0.5或0.6M）中溶解0.1、0.15或0.2g纤维素酶以及0.03、0.05或0.07g离析酶，制成相应浓度的酶液组合；
（6）液体培养基：1/2MS培养基，0.06M蔗糖，0.44M山梨醇，100mlL1椰汁。
1．1．4 分离方法
取幼嫩的蝴蝶兰无菌苗叶片1.0 g（约5片），用新的刀片对取好的叶片进行切割（1.0 mm × 2.0mm），然后置于甘露醇溶液中预处理1h。根据不同处理在10ml甘露醇中溶解相应浓度的纤维素酶和离析酶，配制成酶液。将预处理好的叶片转入50ml三角瓶中，再用注射器和细菌过滤器将酶液慢速注入三角瓶中。将三角瓶放置于摇床上以50rpm转速遮光酶解叶片，酶解时间为57h。试验中4个因素的各个水平如表2所示：
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 原生质体分离 2
1．1．1 试验材料 2
1．1．2 主要仪器用品 2
1．1．3 化学试剂 2
1．1．4 分离方法 2
1．2 原生质体纯化 3
1．2．1 试验材料 3
1．2．2 纯化方法 3
1．3 原生质体产量测定 3
1．3．1 试验材料 3
1．3．2 测定方法 3
1．4 原生质体活力测定 3
1．4．1 试验材料 3
1．4．2 测定方法 3
1．5 原生质体融合 3
1．5．1 试验材料 4
1．5．2 化学试剂 4
1．5．3 融合方法 4
2 结果与分析 4
2．1 蝴蝶兰叶肉细胞原生质体分离条件研究 4
2．1．1 不同酶液组合及酶解时间对蝴蝶兰原生质体分离的影响 4
2．1．2 原生质体纯化条件 5
2．1．3 不同蝴蝶兰品种原生质体分离效果比较 6
2．2 蝴蝶兰叶肉细胞原生质体融合条件研究 6
2．2．1 PEG种类对蝴蝶兰原生质体融合的影响 6
2．2．2 PEG浓度对蝴蝶兰原生质体融合的影响 6
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
/> 2．2．3 PEG处理时间对蝴蝶兰原生质体融合的影响 7
3 讨论 8
3．1 蝴蝶兰叶肉细胞原生质体分离材料 8
3．2 蝴蝶兰叶肉细胞原生质体分离方法 8
3．3 蝴蝶兰叶肉细胞原生质体融合条件 8
致谢 9
参考文献 9
蝴蝶兰叶肉细胞原生质体分离及融合条件研究
引言
蝴蝶兰属于兰科蝴蝶兰属（Phalaenopsis），因其花期长、花色丰富、花姿优雅而得到了广泛栽培，受到了大众的喜爱，素有“洋兰皇后”之称[1]。
蝴蝶兰属于单轴性兰[2]，不能像国兰、石斛兰那样分株繁殖，而无菌播种繁殖也难以保证品种的纯度，因此的繁殖方法比较单一，一般采用组织培养的方式进行。目前蝴蝶兰存在品种更新速度慢，连续继代后性状逐渐退化的问题。分离纯化蝴蝶兰原生质体，并将不同品种蝴蝶兰原生质体进行融合和培养，可以获得体细胞杂种植株，缩短育种周期，对于改良蝴蝶兰品种具有重要的意义。此外，以原生质体为受体，可以进行外源基因的转移，因此原生质体培养技术也是开展蝴蝶兰基因工程研究的有效手段。
为建立高效、稳定的蝴蝶兰原生质体培养技术体系，本试验以不同品种蝴蝶兰无菌苗的叶片为材料，进行原生质体分离及融合条件研究，以期为蝴蝶兰体细胞杂交及基因转移等工作提供技术基础。
1 材料与方法
1．1 原生质体分离
1．1．1 试验材料
以蝴蝶兰黄花品种‘CQY’和红花品种‘780’无菌苗为材料，利用蝴蝶兰生长培养基对其进行连续继代，以获得幼嫩的无菌苗叶片，用于原生质体的分离。蝴蝶兰生长培养基以MS培养基为基本培养基，添加100 ml/L的椰汁，pH为5.6。
1．1．2 主要仪器用品
恒温摇床（上海新苗QYC2102C）、立式压力蒸汽灭菌器（BOXUN）、光学显微镜（Leica DM1000）、荧光显微镜（OLYMPUS BX53）、低速离心机（湘仪L500）、pH计（METTLER TOLEDO）、血球计数板、三角瓶、培养皿、200目筛网、移液器等。
1．1．3 化学试剂
（1）0.4、0.5、0.6M等不同浓度甘露醇溶液；
（2）CPW溶液（表1）；
表1 CPW溶液所含成分（pH5.6）
Table 1 Components of CPW（pH5.6）
成分
含量(mg/L)
KH2PO4
27.200
KNO3
101.000
CaCl2.2H2O
1480.000
MgSO4
246.000
KI
0.160
CuSO4.5H2O
0.025
MES
1000.000
（3）洗液：CPW溶液中添加9%甘露醇；
（4）悬浮液：CPW溶液中添加21%~25%蔗糖；
（5）酶液：10ml甘露醇（浓度为0.4、0.5或0.6M）中溶解0.1、0.15或0.2g纤维素酶以及0.03、0.05或0.07g离析酶，制成相应浓度的酶液组合；
（6）液体培养基：1/2MS培养基，0.06M蔗糖，0.44M山梨醇，100mlL1椰汁。
1．1．4 分离方法
取幼嫩的蝴蝶兰无菌苗叶片1.0 g（约5片），用新的刀片对取好的叶片进行切割（1.0 mm × 2.0mm），然后置于甘露醇溶液中预处理1h。根据不同处理在10ml甘露醇中溶解相应浓度的纤维素酶和离析酶，配制成酶液。将预处理好的叶片转入50ml三角瓶中，再用注射器和细菌过滤器将酶液慢速注入三角瓶中。将三角瓶放置于摇床上以50rpm转速遮光酶解叶片，酶解时间为57h。试验中4个因素的各个水平如表2所示：
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