凹叶厚朴内生真菌代谢产物抗菌活性研究
摘 要本实验以研究药用植物凹叶厚朴内生真菌代谢产物的抗菌活性为主要任务，深入了解凹叶厚朴有效化学成分与其所含内生真菌的关系，探究其有效成分的抗菌活性并推动内生真菌的研究发展，尝试利用内生真菌代谢产物开发新颖抗菌药物，为合理开发利用凹叶厚朴植物资源提供理论依据。实验采用滤纸片法对分离所得内生真菌代谢产物进行体外抑菌活性检测，通过观察是否出现抑菌圈及其大小，对凹叶厚朴内生真菌代谢产物抗菌活性进行初步确定。结果表明待测样品中只有YX-13对革兰氏阳性菌及阴性菌有一定的抑菌活性，且对阴性菌的抑制效果不如阳性菌强。其中YX-13对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为15 mm，对大肠杆菌的抑菌圈直径为6.1 mm。目 录
1 绪论
1.1 凹叶厚朴的研究现状 1
1.1.1 化学成分研究 1
1.1.2 药理作用与临床应用 2
1.1.3 其他作用 3
1.2 内生真菌研究进展与分析 3
1.2.1 植物内生菌产生活性代谢产物的机制 3
1.2.2 植物内生真菌的代谢产物 3
1.2.3 抗肿瘤成分 4
1.2.4 抗菌作用 4
1.2.5 抗氧化作用 4
1.2.6 植物内生真菌的多样性 5
1.3 结语 5
2 实验部分 6
2.1 实验材料 6
2.1.1 实验器材及设备 6
2.1.2 实验器材 6
2.1.3 实验设备 6
2.1.4 实验试剂 6
2.1.5 培养基及主要溶液的配制 6
2.1.6 指示菌 6
2.2 实验步骤 7
2.2.1 平板菌落计数法测定菌落的菌落形成单位 7
2.2.2 计数结果 7
2.3 抑菌实验 8
2.4 实验结果 8
2.4.1 对不同供试菌的抑制作用 11
2.4.2 凹叶厚朴内生真菌发酵液的抑菌
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2.2.1 平板菌落计数法测定菌落的菌落形成单位 7
2.2.2 计数结果 7
2.3 抑菌实验 8
2.4 实验结果 8
2.4.1 对不同供试菌的抑制作用 11
2.4.2 凹叶厚朴内生真菌发酵液的抑菌效果 11
2.4.3 分析与讨论 12
结论 13
参考文献 14
致谢 17
1 绪论
1.1 凹叶厚朴的研究现状
凹叶厚朴是我国常用中草药，具有理气燥湿、平喘止逆的功效，用于脘腹胀痛、呕吐泄沥、逆气喘呕等病症[1]。凹叶厚朴属于国家规定的二级保护植物，主产于陕西、云贵川，江西等地[2]。主要成分为厚朴酚及和厚朴酚，因其具有良好的抗菌效果[2]，所以临床上凹叶厚朴多以复方入药，且需求量很大。凹叶厚朴因其入药部位为植物干燥皮，枝皮或树皮，且生长缓慢，曾出现凹叶厚朴资源匮乏，前些年，国内主要采用环剥技术保存资源。虽然目前人们已经开始大面积种植凹叶厚朴，但放眼未来，凹叶厚朴资源仍显不足。这一问题若得不到根本性解决，未来很可能会导致生态失衡，造成对自然环境以及生物圈不可弥补的损害。
1.1.1 化学成分研究
1.1.1.1 酚类
凹叶厚朴中含有多种酚类物质，在厚朴中占5%[3]，主要的活性物质为和厚朴酚与厚朴酚，此外还含有异厚朴酚、龙脑基厚朴酚、四氢厚朴酚、辣薄荷基厚朴酚等[4]。厚朴酚主要存在于厚朴或凹叶厚朴的干皮，根皮及枝皮，具有抗菌，抗病毒，抗氧化，抗肿瘤等药理作用。临床上主要用作抗菌，抗病毒药等[56]。因其具有这些优点，近年来市场上一些口服药物制剂、化妆用品、防晒霜中均含有厚朴酚。
1.1.1.2 挥发油类
凹叶厚朴挥发油中含有多种成分，其中有效成分种类很多。经GCMS鉴定出48种化合物[7]，其中桉叶醇的含量最高，在挥发油总量中占有40%~50%，此外还含有别香橙烯、乙酸龙脑酯、榄香醇等[8]。通过相关研究表明不同原产地厚朴中挥发油的成分及相对含量存在明显差异，不过这些成分在很大程度上还是决定了归属于不同产地的药材及其关于药效方面的相似性[9]。
1.1.1.3 生物碱类
凹叶厚朴中所含有的生物碱类成分主要为厚朴碱，此外还有白兰花碱、木兰花碱、木兰箭毒碱、武当木兰碱、罗默碱及阿朴啡生物碱类化合物等[10]，番荔枝碱、鹅掌楸碱[11]。
1.1.1.4 其他类
鹅掌揪树脂醇A(lirioresinol A)、6,7二甲氧基香豆素(6,7dimethoxycoumarin)、吲哚3甲醛(indole3aldehyde)、对烯丙基苯酚(4 allylphenol)、正二十九烷酸(nonacosanoic acid)紫丁香苷此外，凹叶厚朴中尚含有钾、镁、钙、铁、钠等微量元素及少量的皂苷等[12]。
1.1.2 药理作用及临床应用
1.1.2.1 抗氧化、降压、抗聚作用
抗氧化作用：以烘箱法、0SI（Oxidative Stability Instrument）法测定厚朴的乙醇氯仿(2:1)提取物的抗氧化活性，结果表明，其对猪油(OSI法100 ℃通气)的Pf(抗氧化保护系数)和花生油(烘箱法60 ℃)均大于1.2[13],实验结果证实厚朴酚与和厚朴酚均具有抗氧化活性。降压作用：厚朴的某些生物碱如木兰箭毒碱和厚朴碱均有降压作用。抗聚作用：厚朴酚、和朴酚能明显抑制由胶原等诱导的兔血小板聚集和ATP的释放，还可抑制诱导的兔血小板血栓素B2的产生。
1.1.2.2 抗菌、抗病毒、抗癌作用
抗菌及抗病毒：厚朴煎剂具很强的抗菌作用。其煎剂在体外对一些致病菌如痢疾杆菌、伤寒杆菌、肺炎双球菌等都有抑制作用。以和厚朴酚标准品为实验材料测定其对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的抑菌活性，得和厚朴酚的抑菌浓度在10 mg/L以内；另以厚朴煎液对耐药金黄色葡萄球菌极其敏感。另外，其对体内炭疽杆菌也表现出很强的抗菌活性，已初步断定其活性物质为厚朴酚；另对幽门螺杆菌(HP)也有很好的抑制作用。厚朴酚与和厚朴酚的抑菌效果对突变链球菌的作用也很好。在讨论厚朴酚抗大肠杆菌是否干扰菌群在肠道的正常生长时，在液体培养液中观察到即使厚朴酚浓度达到500 ug/mL，每一株菌群也都可以正常生长。同时，打孔的固体培养基内滴入10 mg/mL的厚朴酚，其周围亦看不到见明显的抑菌圈。厚朴叶中提取的总酚对能引发棉苗立枯病等在内的多种真菌抑制作用都很强，深入探究发现粗提物中的抑菌物为和厚朴酚与厚朴酚，这两者对细菌的抑制活性相差不大，在农药应用方面具有良好的价值。厚朴酚、和厚朴酚在抗龋齿方面有显著的作用，大多数学者认为起这样的作用是通过抗口腔中链球菌突变株实现的。抗癌方面：凹叶厚朴中的成分脂多糖可通过激活其本身的活性物质来抑制肿瘤坏死因子的增殖，深入研究证实凹叶厚朴中产生抑制作用的活性成分包括和厚朴酚，厚朴酚及新木脂素类，产生抑制作用的这些成分在剂
1 绪论
1.1 凹叶厚朴的研究现状 1
1.1.1 化学成分研究 1
1.1.2 药理作用与临床应用 2
1.1.3 其他作用 3
1.2 内生真菌研究进展与分析 3
1.2.1 植物内生菌产生活性代谢产物的机制 3
1.2.2 植物内生真菌的代谢产物 3
1.2.3 抗肿瘤成分 4
1.2.4 抗菌作用 4
1.2.5 抗氧化作用 4
1.2.6 植物内生真菌的多样性 5
1.3 结语 5
2 实验部分 6
2.1 实验材料 6
2.1.1 实验器材及设备 6
2.1.2 实验器材 6
2.1.3 实验设备 6
2.1.4 实验试剂 6
2.1.5 培养基及主要溶液的配制 6
2.1.6 指示菌 6
2.2 实验步骤 7
2.2.1 平板菌落计数法测定菌落的菌落形成单位 7
2.2.2 计数结果 7
2.3 抑菌实验 8
2.4 实验结果 8
2.4.1 对不同供试菌的抑制作用 11
2.4.2 凹叶厚朴内生真菌发酵液的抑菌
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2.2.1 平板菌落计数法测定菌落的菌落形成单位 7
2.2.2 计数结果 7
2.3 抑菌实验 8
2.4 实验结果 8
2.4.1 对不同供试菌的抑制作用 11
2.4.2 凹叶厚朴内生真菌发酵液的抑菌效果 11
2.4.3 分析与讨论 12
结论 13
参考文献 14
致谢 17
1 绪论
1.1 凹叶厚朴的研究现状
凹叶厚朴是我国常用中草药，具有理气燥湿、平喘止逆的功效，用于脘腹胀痛、呕吐泄沥、逆气喘呕等病症[1]。凹叶厚朴属于国家规定的二级保护植物，主产于陕西、云贵川，江西等地[2]。主要成分为厚朴酚及和厚朴酚，因其具有良好的抗菌效果[2]，所以临床上凹叶厚朴多以复方入药，且需求量很大。凹叶厚朴因其入药部位为植物干燥皮，枝皮或树皮，且生长缓慢，曾出现凹叶厚朴资源匮乏，前些年，国内主要采用环剥技术保存资源。虽然目前人们已经开始大面积种植凹叶厚朴，但放眼未来，凹叶厚朴资源仍显不足。这一问题若得不到根本性解决，未来很可能会导致生态失衡，造成对自然环境以及生物圈不可弥补的损害。
1.1.1 化学成分研究
1.1.1.1 酚类
凹叶厚朴中含有多种酚类物质，在厚朴中占5%[3]，主要的活性物质为和厚朴酚与厚朴酚，此外还含有异厚朴酚、龙脑基厚朴酚、四氢厚朴酚、辣薄荷基厚朴酚等[4]。厚朴酚主要存在于厚朴或凹叶厚朴的干皮，根皮及枝皮，具有抗菌，抗病毒，抗氧化，抗肿瘤等药理作用。临床上主要用作抗菌，抗病毒药等[56]。因其具有这些优点，近年来市场上一些口服药物制剂、化妆用品、防晒霜中均含有厚朴酚。
1.1.1.2 挥发油类
凹叶厚朴挥发油中含有多种成分，其中有效成分种类很多。经GCMS鉴定出48种化合物[7]，其中桉叶醇的含量最高，在挥发油总量中占有40%~50%，此外还含有别香橙烯、乙酸龙脑酯、榄香醇等[8]。通过相关研究表明不同原产地厚朴中挥发油的成分及相对含量存在明显差异，不过这些成分在很大程度上还是决定了归属于不同产地的药材及其关于药效方面的相似性[9]。
1.1.1.3 生物碱类
凹叶厚朴中所含有的生物碱类成分主要为厚朴碱，此外还有白兰花碱、木兰花碱、木兰箭毒碱、武当木兰碱、罗默碱及阿朴啡生物碱类化合物等[10]，番荔枝碱、鹅掌楸碱[11]。
1.1.1.4 其他类
鹅掌揪树脂醇A(lirioresinol A)、6,7二甲氧基香豆素(6,7dimethoxycoumarin)、吲哚3甲醛(indole3aldehyde)、对烯丙基苯酚(4 allylphenol)、正二十九烷酸(nonacosanoic acid)紫丁香苷此外，凹叶厚朴中尚含有钾、镁、钙、铁、钠等微量元素及少量的皂苷等[12]。
1.1.2 药理作用及临床应用
1.1.2.1 抗氧化、降压、抗聚作用
抗氧化作用：以烘箱法、0SI（Oxidative Stability Instrument）法测定厚朴的乙醇氯仿(2:1)提取物的抗氧化活性，结果表明，其对猪油(OSI法100 ℃通气)的Pf(抗氧化保护系数)和花生油(烘箱法60 ℃)均大于1.2[13],实验结果证实厚朴酚与和厚朴酚均具有抗氧化活性。降压作用：厚朴的某些生物碱如木兰箭毒碱和厚朴碱均有降压作用。抗聚作用：厚朴酚、和朴酚能明显抑制由胶原等诱导的兔血小板聚集和ATP的释放，还可抑制诱导的兔血小板血栓素B2的产生。
1.1.2.2 抗菌、抗病毒、抗癌作用
抗菌及抗病毒：厚朴煎剂具很强的抗菌作用。其煎剂在体外对一些致病菌如痢疾杆菌、伤寒杆菌、肺炎双球菌等都有抑制作用。以和厚朴酚标准品为实验材料测定其对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的抑菌活性，得和厚朴酚的抑菌浓度在10 mg/L以内；另以厚朴煎液对耐药金黄色葡萄球菌极其敏感。另外，其对体内炭疽杆菌也表现出很强的抗菌活性，已初步断定其活性物质为厚朴酚；另对幽门螺杆菌(HP)也有很好的抑制作用。厚朴酚与和厚朴酚的抑菌效果对突变链球菌的作用也很好。在讨论厚朴酚抗大肠杆菌是否干扰菌群在肠道的正常生长时，在液体培养液中观察到即使厚朴酚浓度达到500 ug/mL，每一株菌群也都可以正常生长。同时，打孔的固体培养基内滴入10 mg/mL的厚朴酚，其周围亦看不到见明显的抑菌圈。厚朴叶中提取的总酚对能引发棉苗立枯病等在内的多种真菌抑制作用都很强，深入探究发现粗提物中的抑菌物为和厚朴酚与厚朴酚，这两者对细菌的抑制活性相差不大，在农药应用方面具有良好的价值。厚朴酚、和厚朴酚在抗龋齿方面有显著的作用，大多数学者认为起这样的作用是通过抗口腔中链球菌突变株实现的。抗癌方面：凹叶厚朴中的成分脂多糖可通过激活其本身的活性物质来抑制肿瘤坏死因子的增殖，深入研究证实凹叶厚朴中产生抑制作用的活性成分包括和厚朴酚，厚朴酚及新木脂素类，产生抑制作用的这些成分在剂
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