蚂蟥冬眠期间细胞凋亡与自噬相关基因表达的研究
目的通过测定蚂蟥冬眠不同时期细胞凋亡与自噬相关基因的表达，从基因组学的角度来研究冬眠蚂蟥细胞凋亡与自噬相关基因表达的变化 方法通过荧光定量PCR技术检测蚂蟥冬眠不同时间AIF1、caspase-3、caspase-8、ATG3、ATG7、bcl-2、Beclin-1的表达的变化 结果研究发现，在整个冬眠处理过程中，细胞凋亡相关的基因AIF1、caspase-3、caspase-8、bcl-2等整体表现为先降低后升高的变化趋势，在深冬眠时期的表达量达到最低值；细胞自噬相关的基因ATG3、ATG7、beclin1等整体表现为先升高后降低的变化趋势，在深冬眠时期表达量达到最高值。变化趋势明显，差别显著。结论冬眠期间，蚂蟥细胞凋亡的水平降低，细胞自噬的水平升高。
目录
摘要 3
Abstract 3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1 材料 4
1.1.1实验动物 4
1.1.2实验仪器 4
1.1.3实验试剂 4
1.2方法 4
1.2.1实验设计 4
1.2.2引物设计 4
1.2.3蚂蟥消化道总RNA的提取 5
1.2.4 RNA的鉴定 5
1.2.5去除基因组DNA和cDNA的合成 5
1.2.6 Realtime PCR测定AIF1，ATG3、ATG7、caspase3、caspase8、bcl2和Beclin1表达量 5
1.2.7统计分析 6
2 结果与分析 6
2.1 蚂蟥冬眠不同时期AIF1表达的变化 6
2.2 蚂蟥冬眠不同时期caspase3，caspase8表达的变化 6
2.3 蚂蟥冬眠不同时期bcl2表达的变化 7
2.4 蚂蟥冬眠不同时期ATG3，ATG7表达的变化 7
2.5 蚂蟥冬眠不同时期Beclin1表达的变化 8
3 讨论 8
3.1 冬眠处理对蚂蟥细胞凋亡基因表达的影响 8
3.2 冬眠处理对蚂蟥细胞自噬基因表达的影响 9
3.3 冬眠处 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
理过程中蚂蟥细胞自噬和凋亡的相互作用 10
蚂蟥冬眠期间细胞凋亡与自噬相关基因表达的研究
学生 王帅
引言
蚂蟥Whitmania pigra Whitman，又称宽体金线蛭，是2015版《中国药典》中收录的中药材水蛭的基原动物之一[1]。具有破血消症、逐瘀通经之功效，具有显著的抗血小板凝集、降低血液粘稠度、预防血栓形成的作用，用于血癖经闭，中风偏瘫，撤瘤痞块，跌扑损伤。蚂蟥也是典型的冬眠动物，当环境温度降低到一定程度的时候，蚂蟥会出现停止进食，减少活动甚至冬眠来度过寒冷的冬季。随着医药市场对中药材水蛭的需求急剧增加，以及环境污染等问题的日益加重，导致了蚂蟥野生的资源几近枯竭。近年来，对于蚂蟥的研究取得了长足的进展，大学中药材研究所蚂蟥实验室对于蚂蟥的呼吸、摄食规律、消化生理以及生理生化等方面的研究取得了骄人的成果[2][3][4][5][6][7]。然而，目前关于蚂蟥冬眠期间细胞凋亡和细胞自噬的研究还未见报道，本实验拟通过研究蚂蟥冬眠期间细胞凋亡和细胞自噬相关基因的表达的变化，为进一步研究蚂蟥冬眠期间的细胞凋亡和自噬的调控机制提供理论基础和科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1实验动物
实验用蚂蟥由大学中药材研究所蚂蟥实验室提供，经史红专副教授鉴定为蚂蟥Whitmania pigra Whitman；实验所用螺蛳（采自南京前湖，野生）为梨形环棱螺Bellamya purificata Heude。
1.1.2实验仪器
电子天平（山海精密仪器厂）；实时荧光定量PCR仪（美国ABI Step one7500）；PCR仪（PTC200，bioRAD）；电泳仪（DYY6C，北京六一仪器厂）；凝胶成像仪（JS380，上海培清科技有限公司）；SYBR? Premix Ex Taq? (Tli RNaseH Plus)（上海皓嘉科技发展有限公司）；PrimeScript. RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) （上海皓嘉科技发展有限公司）
1.1.3实验试剂
loading buffer；Marker；TRIzol；RNAiso plus（宝生物工程有限公司（大连））；琼脂；氯仿；异丙醇；乙醇
1.2方法
1.2.1实验设计
实验用蚂蟥采自大学中药材研究所蚂蟥实验室，选取健康蚂蟥（Whitmania pigra）活体材料100条，体重约为15 g，根据冬眠周期分为5组处理，分别为：
（1）对照组（active leeches，AC）
（2）初冬眠组（entrance into hibernation，EH）
（3）深冬眠组（deep hibernation，DH）（4℃以下培养超过50天）
（4）早期苏醒组（early arousal，EA）（深冬眠的蚂蟥复温25℃，0.5h）
（5）出冬眠活跃组（active after hibernation，AAH）
每组随机选取3条蚂蟥，至于盛水2/3广口玻璃瓶中。
1.2.2引物设计
表1.PCR引物
Table1.primers used for PCR
引物名称
引物序列
AIF1
上游引物5’TGTTTCAGTGGGATTGGACCCT3’
下游引物3’ CCCTCCTGCGACCCAACTT5’
目录
摘要 3
Abstract 3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1 材料 4
1.1.1实验动物 4
1.1.2实验仪器 4
1.1.3实验试剂 4
1.2方法 4
1.2.1实验设计 4
1.2.2引物设计 4
1.2.3蚂蟥消化道总RNA的提取 5
1.2.4 RNA的鉴定 5
1.2.5去除基因组DNA和cDNA的合成 5
1.2.6 Realtime PCR测定AIF1，ATG3、ATG7、caspase3、caspase8、bcl2和Beclin1表达量 5
1.2.7统计分析 6
2 结果与分析 6
2.1 蚂蟥冬眠不同时期AIF1表达的变化 6
2.2 蚂蟥冬眠不同时期caspase3，caspase8表达的变化 6
2.3 蚂蟥冬眠不同时期bcl2表达的变化 7
2.4 蚂蟥冬眠不同时期ATG3，ATG7表达的变化 7
2.5 蚂蟥冬眠不同时期Beclin1表达的变化 8
3 讨论 8
3.1 冬眠处理对蚂蟥细胞凋亡基因表达的影响 8
3.2 冬眠处理对蚂蟥细胞自噬基因表达的影响 9
3.3 冬眠处 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
理过程中蚂蟥细胞自噬和凋亡的相互作用 10
蚂蟥冬眠期间细胞凋亡与自噬相关基因表达的研究
学生 王帅
引言
蚂蟥Whitmania pigra Whitman，又称宽体金线蛭，是2015版《中国药典》中收录的中药材水蛭的基原动物之一[1]。具有破血消症、逐瘀通经之功效，具有显著的抗血小板凝集、降低血液粘稠度、预防血栓形成的作用，用于血癖经闭，中风偏瘫，撤瘤痞块，跌扑损伤。蚂蟥也是典型的冬眠动物，当环境温度降低到一定程度的时候，蚂蟥会出现停止进食，减少活动甚至冬眠来度过寒冷的冬季。随着医药市场对中药材水蛭的需求急剧增加，以及环境污染等问题的日益加重，导致了蚂蟥野生的资源几近枯竭。近年来，对于蚂蟥的研究取得了长足的进展，大学中药材研究所蚂蟥实验室对于蚂蟥的呼吸、摄食规律、消化生理以及生理生化等方面的研究取得了骄人的成果[2][3][4][5][6][7]。然而，目前关于蚂蟥冬眠期间细胞凋亡和细胞自噬的研究还未见报道，本实验拟通过研究蚂蟥冬眠期间细胞凋亡和细胞自噬相关基因的表达的变化，为进一步研究蚂蟥冬眠期间的细胞凋亡和自噬的调控机制提供理论基础和科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1实验动物
实验用蚂蟥由大学中药材研究所蚂蟥实验室提供，经史红专副教授鉴定为蚂蟥Whitmania pigra Whitman；实验所用螺蛳（采自南京前湖，野生）为梨形环棱螺Bellamya purificata Heude。
1.1.2实验仪器
电子天平（山海精密仪器厂）；实时荧光定量PCR仪（美国ABI Step one7500）；PCR仪（PTC200，bioRAD）；电泳仪（DYY6C，北京六一仪器厂）；凝胶成像仪（JS380，上海培清科技有限公司）；SYBR? Premix Ex Taq? (Tli RNaseH Plus)（上海皓嘉科技发展有限公司）；PrimeScript. RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) （上海皓嘉科技发展有限公司）
1.1.3实验试剂
loading buffer；Marker；TRIzol；RNAiso plus（宝生物工程有限公司（大连））；琼脂；氯仿；异丙醇；乙醇
1.2方法
1.2.1实验设计
实验用蚂蟥采自大学中药材研究所蚂蟥实验室，选取健康蚂蟥（Whitmania pigra）活体材料100条，体重约为15 g，根据冬眠周期分为5组处理，分别为：
（1）对照组（active leeches，AC）
（2）初冬眠组（entrance into hibernation，EH）
（3）深冬眠组（deep hibernation，DH）（4℃以下培养超过50天）
（4）早期苏醒组（early arousal，EA）（深冬眠的蚂蟥复温25℃，0.5h）
（5）出冬眠活跃组（active after hibernation，AAH）
每组随机选取3条蚂蟥，至于盛水2/3广口玻璃瓶中。
1.2.2引物设计
表1.PCR引物
Table1.primers used for PCR
引物名称
引物序列
AIF1
上游引物5’TGTTTCAGTGGGATTGGACCCT3’
下游引物3’ CCCTCCTGCGACCCAACTT5’
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