蚂蟥冬眠过程中糖脂肪蛋白质关键酶基因表达的研究
目的通过测定蚂蟥在冬眠期间体内糖、脂肪、蛋白质代谢相关酶基因的表达，研究蚂蟥冬眠期间物质代谢的机理。方法选取冬眠0、30、60、90d及正常25℃停食2d蚂蟥的肌肉和消化道，通过实时荧光定量PCR测量相关基因表达。结果表明消化道中PK、FBP、PEPCK、ACC、HSL、TLSP、AST、GDH基因在冬眠期间的表达呈现先上升后下降的趋势，肌肉中除FBP基因冬眠时期呈先下降、上升、下降的趋势外，其余基因均呈先上升再下降的趋势，且在60d前后达到最高，差异显著（P＜0.05）。结论蚂蟥在冬眠初期会降低自身代谢，随着冬眠时间的增长，会通过消耗自身物质提供能量。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1．1．1 仪器与试剂 2
1．1．2 实验动物 2
1．2 方法 2
1．2．1 蚂蟥冬眠模型的设计 2
1．2．2 样品的采集与保存 2
1．2．3 RNA提取与cDNA合成 2
1．2．4 引物特异性检测 2
1．2．5 蚂蟥不同部位物质代谢酶基因及抗凝基因表达量的测定 3
1．2．6 数据分析 3
2 结果与分析 3
2．1 RNA提取质量 3
2．2 引物特性检测 3
2．3 冬眠对蚂蟥糖代谢相关酶基因表达量的影响 4
2．4 冬眠对蚂蟥脂肪代谢相关酶基因表达量的影响 5
2．4 冬眠对蚂蟥氨基酸代谢相关酶基因表达量的影响 5
3 讨论 6
3．1 蚂蟥冬眠及冬眠过程中糖的利用 6
3．2 蚂蟥冬眠及冬眠过程中脂肪的利用 6
3．3 蚂蟥冬眠及冬眠过程中蛋白质的利用 7
小结 7
致谢 7
参考文献 8
蚂蟥冬眠过程中糖、脂肪、蛋白质关键酶基因表达的研究
学生 齐恒基
引言 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
蚂蟥（Whitmania pigra Whitman），水蛭科动物，别名宽体金线蛭，其干燥全体是药材水蛭的主要基原动物，具有破血消症，逐瘀通经的功效[1]，是治疗心脑血管中成药的主要原料。近年来由于野外生存环境污染和市场需求的加大，蚂蟥的供需矛盾日益凸显，人工养殖备受重视。
冬眠是指某些动物为了躲避严寒低温的不利条件，而表现的一种特殊生理状态[2]。在冬眠状态下，变温动物会表现为体温降低、代谢率降低以及心率和呼吸频率下降等行为。蚂蟥作为变温动物，“冬眠”是其一固有生态习性[3]，当外界环境温度降低到一定程度时，蚂蟥会逐渐减少自身活动进入冬眠，这极大程度的影响了其生长，降低了养殖的生产效率和经济效益，为人工养殖带来不便。
目前对蚂蟥的研究主要集中在药理、生理、组织结构、内在品质、遗传多样性等[49]。而尚未有冬眠对蚂蟥生长性能、物质代谢关键酶基因影响的研究。本实验拟以蚂蟥为实验材料，研究冬眠过程中蚂蟥生长、能量收支的变化，来阐述蚂蟥冬眠过程中能量利用策略，有助于进一步理解蚂蟥冬眠的生态学意义，同时也为人工养殖蚂蟥的安全越冬提供指导。
1 材料与方法
1．1 材料
1.1.1 仪器与试剂 实时荧光定量PCR仪（美国ABI Step one7500）；PCR仪（PTC200，bioRAD）；FYLYS108L低温保存箱（北京福意电器有限公司）；XHFD内切式匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；5810R离心机（Eppendorf公司）；电泳仪（DYY6C，北京六一仪器厂）；Alpha1506型紫外可见分光光度计（上海谱元仪器有限公司），FA 1104分析天平（上海精科天平）。
Trizol RNA 抽提试剂、SYBR Green mixture、PrimeScript TR Master Mix、TaqDNA 聚合酶、dNTP、DNA 标准品( DL2000) 均购自 TaKaRa 公司; 胶回收试剂盒和八联管为美国 Axygen 公司产品。引物的合成及扩增产物的序列测定均由上海英潍捷基贸易有限公司完成。
1.1.2 实验动物 蚂蟥由大学中药材研究所提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥Whitmania pigra Whitman。
1．2 方法
1.2.1 蚂蟥冬眠模型的设计[3] 试验用蚂蟥统一暂养于透明玻璃缸中7 d，期间以天然饵料螺蛳（采集于南京前湖，野生，经郭巧生教授鉴定为梨形环棱螺B.purificata）常规饲喂。试验前停食2 d，随机选取10 g左右体格健壮的蚂蟥，置于480 mL注水2/3体积的广口玻璃瓶中，每瓶3条蚂蟥为一组，共设置30组。初始温度为25℃，以1℃/ d的速率降温至4℃，稳定。试验期间不投喂食物，虹吸法每天换1/2 体积4℃预冷且曝气的自来水。
1.2.2 样品的采集与保存 于25℃养殖停食2 d后以及蚂蟥4℃冬眠0、30、60、90d取样，各时期分别记为ST、H0、H30、H60、H90。取各时刻蚂蟥9条，冰盘解剖，分别取蚂蟥肌肉和消化道组织，80℃保存，进行相关代谢酶基因及抗凝基因含量的测定。
1.2.3 RNA提取与cDNA合成 Trizol法有快速、高效、稳定的特点[10]，利用Trizol法提取总RNA，具体方法为：液氮中迅速研磨后，将粉末移入1.5mL装有1mL Trizol的EP管（提前加好Trizol）中，剧烈震荡15 s，并在室温放置3 min（配平）。4℃，12000r，10min离心；取上清液（600ul）200ul×3次至另一离心管（勿吸到底部），加入0.2mL氯仿，颠倒混匀10次，室温放置2~3 min（配平），4℃，12000离心10 min。弃上清，加入1 mL预冷的75%乙醇，将底部沉淀弹起使其漂浮在乙醇中，温和洗涤1 min，4℃，7500 rmin1，离心5 min。弃上清，空气中或真空干燥。加入50μL 0.1%的DEPC水溶解。提取后用琼脂糖胶电泳检测RNA的质量，并使用核酸检测仪检测所提RNA的浓度和纯度。取10μL RNA作为模板，按照反转录试剂盒说明书进行反转录得到cDNA第一链。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1．1．1 仪器与试剂 2
1．1．2 实验动物 2
1．2 方法 2
1．2．1 蚂蟥冬眠模型的设计 2
1．2．2 样品的采集与保存 2
1．2．3 RNA提取与cDNA合成 2
1．2．4 引物特异性检测 2
1．2．5 蚂蟥不同部位物质代谢酶基因及抗凝基因表达量的测定 3
1．2．6 数据分析 3
2 结果与分析 3
2．1 RNA提取质量 3
2．2 引物特性检测 3
2．3 冬眠对蚂蟥糖代谢相关酶基因表达量的影响 4
2．4 冬眠对蚂蟥脂肪代谢相关酶基因表达量的影响 5
2．4 冬眠对蚂蟥氨基酸代谢相关酶基因表达量的影响 5
3 讨论 6
3．1 蚂蟥冬眠及冬眠过程中糖的利用 6
3．2 蚂蟥冬眠及冬眠过程中脂肪的利用 6
3．3 蚂蟥冬眠及冬眠过程中蛋白质的利用 7
小结 7
致谢 7
参考文献 8
蚂蟥冬眠过程中糖、脂肪、蛋白质关键酶基因表达的研究
学生 齐恒基
引言 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
蚂蟥（Whitmania pigra Whitman），水蛭科动物，别名宽体金线蛭，其干燥全体是药材水蛭的主要基原动物，具有破血消症，逐瘀通经的功效[1]，是治疗心脑血管中成药的主要原料。近年来由于野外生存环境污染和市场需求的加大，蚂蟥的供需矛盾日益凸显，人工养殖备受重视。
冬眠是指某些动物为了躲避严寒低温的不利条件，而表现的一种特殊生理状态[2]。在冬眠状态下，变温动物会表现为体温降低、代谢率降低以及心率和呼吸频率下降等行为。蚂蟥作为变温动物，“冬眠”是其一固有生态习性[3]，当外界环境温度降低到一定程度时，蚂蟥会逐渐减少自身活动进入冬眠，这极大程度的影响了其生长，降低了养殖的生产效率和经济效益，为人工养殖带来不便。
目前对蚂蟥的研究主要集中在药理、生理、组织结构、内在品质、遗传多样性等[49]。而尚未有冬眠对蚂蟥生长性能、物质代谢关键酶基因影响的研究。本实验拟以蚂蟥为实验材料，研究冬眠过程中蚂蟥生长、能量收支的变化，来阐述蚂蟥冬眠过程中能量利用策略，有助于进一步理解蚂蟥冬眠的生态学意义，同时也为人工养殖蚂蟥的安全越冬提供指导。
1 材料与方法
1．1 材料
1.1.1 仪器与试剂 实时荧光定量PCR仪（美国ABI Step one7500）；PCR仪（PTC200，bioRAD）；FYLYS108L低温保存箱（北京福意电器有限公司）；XHFD内切式匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；5810R离心机（Eppendorf公司）；电泳仪（DYY6C，北京六一仪器厂）；Alpha1506型紫外可见分光光度计（上海谱元仪器有限公司），FA 1104分析天平（上海精科天平）。
Trizol RNA 抽提试剂、SYBR Green mixture、PrimeScript TR Master Mix、TaqDNA 聚合酶、dNTP、DNA 标准品( DL2000) 均购自 TaKaRa 公司; 胶回收试剂盒和八联管为美国 Axygen 公司产品。引物的合成及扩增产物的序列测定均由上海英潍捷基贸易有限公司完成。
1.1.2 实验动物 蚂蟥由大学中药材研究所提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥Whitmania pigra Whitman。
1．2 方法
1.2.1 蚂蟥冬眠模型的设计[3] 试验用蚂蟥统一暂养于透明玻璃缸中7 d，期间以天然饵料螺蛳（采集于南京前湖，野生，经郭巧生教授鉴定为梨形环棱螺B.purificata）常规饲喂。试验前停食2 d，随机选取10 g左右体格健壮的蚂蟥，置于480 mL注水2/3体积的广口玻璃瓶中，每瓶3条蚂蟥为一组，共设置30组。初始温度为25℃，以1℃/ d的速率降温至4℃，稳定。试验期间不投喂食物，虹吸法每天换1/2 体积4℃预冷且曝气的自来水。
1.2.2 样品的采集与保存 于25℃养殖停食2 d后以及蚂蟥4℃冬眠0、30、60、90d取样，各时期分别记为ST、H0、H30、H60、H90。取各时刻蚂蟥9条，冰盘解剖，分别取蚂蟥肌肉和消化道组织，80℃保存，进行相关代谢酶基因及抗凝基因含量的测定。
1.2.3 RNA提取与cDNA合成 Trizol法有快速、高效、稳定的特点[10]，利用Trizol法提取总RNA，具体方法为：液氮中迅速研磨后，将粉末移入1.5mL装有1mL Trizol的EP管（提前加好Trizol）中，剧烈震荡15 s，并在室温放置3 min（配平）。4℃，12000r，10min离心；取上清液（600ul）200ul×3次至另一离心管（勿吸到底部），加入0.2mL氯仿，颠倒混匀10次，室温放置2~3 min（配平），4℃，12000离心10 min。弃上清，加入1 mL预冷的75%乙醇，将底部沉淀弹起使其漂浮在乙醇中，温和洗涤1 min，4℃，7500 rmin1，离心5 min。弃上清，空气中或真空干燥。加入50μL 0.1%的DEPC水溶解。提取后用琼脂糖胶电泳检测RNA的质量，并使用核酸检测仪检测所提RNA的浓度和纯度。取10μL RNA作为模板，按照反转录试剂盒说明书进行反转录得到cDNA第一链。
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