高ra甜叶菊辅助选择育种estssr分子标记开发
本实验以甜叶菊转录组数据为基础，基于EST-SSR分子标记为手段，通过分析甜叶菊EST-SSR与甜叶菊RA含量之间的关系，设计了85对EST-SSR引物，所得的PCR产物分别用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺胶进行分离，通过PAGE对23个甜叶菊个体总体分析，其多态位点为31，多态性比率为71.7%。基于遗传相似系数的UPGMA聚类分析将甜叶菊的三个大类群明显聚为 2支，将23个材料聚类为5大支。在筛选出的31号引物中，在180bp的位置上，4种高RA的甜叶菊所得的扩增片段与其他甜叶菊相比缺失一条带，因此，31号引物有望成为筛选高RA甜叶菊材料的EST-SSR引物。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1. 1 实验材料、试剂及仪器 2
1．1．1 实验材料 2
1．1．2 实验试剂 2
1．1．3 实验仪器 2
1．2 实验方法 2
1．2．1 甜叶菊采集 2
1．2．2 DNA提取 3
1．2．3 PCR扩增 3
1．2．3．1 PCR扩增前实验准备 3
1．2．3．2 PCR扩增反应体系及反应条件 3
1．2．3．3 PCR产物的电泳分离 4
2 结果与分析 4
2．1 DNA提取结果 4
2．2 PCR反应结果 5
2．2．1 以全池为模板PCR结果 5
2．2．2 以半池为模板PCR结果 6
2．2．3 以单个材料为模板PCR结果 10
2．3 遗传多样性分析 13
2.3.1 三类糖苷含量不同的甜叶菊类群间及个体间的遗传距离和聚类分析 13
2.3.2 甜叶菊遗传多样性分析 15
2.3.3 甜叶菊糖苷含量鉴别用引物 15
3 讨论 16
致谢 16
参考文献 16
图1 甜叶菊基因组DNA 4
图2 以全池为模板PCR结果 5
图3 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
以半池为模板PCR结果（1） 6
图3 以半池为模板PCR结果（2） 6
图3 以半池为模板PCR结果（3） 7
图3以半池为模板PCR结果（4） 7
图4 以半池为模板PAGE结果 9
图5 以单个材料为模板PCR结果（1） 10
图5 以单个材料为模板PCR结果（2） 10
图6 甜叶菊基因组DNA重提结果 11
图7 重提DNA的PCR结果 11
图8 4号引物以单个材料为模板PCR反应后PAGE电泳结果 12
图9 20号引物以单个材料为模板PCR反应后PAGE电泳结果 12
图10 58号引物以单个材料为模板PCR反应后PAGE电泳结果 12
图11 68号引物以单个材料为模板PCR反应后PAGE电泳结果 13
图12 三大群体聚类 14
图13 23个个体聚类 14
图14 31号引物以单个材料为模板PCR结果 15
图19 31号引物以单个材料为模板PAGE电泳结果 15
表1 甜叶菊中糖苷含量情况 3
表2 8%聚丙烯酰胺凝胶配方 4
表3 DNA浓度 5
表4 具有多态性的19对ESTSSR引物详细信息 8
表5 以半池为模板所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳的遗传相似系数和遗传距离 13
表6 以半池为模板所得PCR产物经PAGE电泳的遗传相似系数和遗传距离 13
表7 以个体为模板所得PCR产物经PAGE电泳的总体遗传相似系数和遗传距离 13
表8 甜叶菊遗传多样性 15
高RA甜叶菊辅助选择育种ESTSSR分子标记开发
引言
甜叶菊（S. rebaudiana）原产地并非中国，而是巴拉圭，因此甜叶菊产业在中国起步较晚。甜叶菊作为一种以叶片为主要经济来源的农作物，属于菊科草本植物[1]，并且多年生，因此可以产生较好的经济效益。甜叶菊成为目前主要经济作物的原因是在其体内含有多种糖苷。据相关报道称，到目前为止，就已经在其叶片中检测到四十多种甜菊糖苷[24]。甜叶菊中的糖苷种类众多，但并非每一种都可以用于商品生产，由于糖苷的结构不同，人们对其味觉上的感知也会有所不同，甜叶菊中的糖苷以莱鲍迪苷A（RA）和甜菊苷（STV）为主[56]，就这两种糖苷而言，STV在入口过后，往往伴随着后苦味，而RA口感纯正，跟蔗糖口味比较接近[9]。甜菊糖苷的应用之所以越来越广，是因为它有着高甜度低热量的优良特性，以甜菊苷为例，与蔗糖相比，其甜度高出蔗糖300倍，而蔗糖的热量却高出甜菊苷的300倍，如此大的悬殊造就了甜菊糖苷作为一种甜味添加剂的优良特性，并且甜菊糖苷也日益广泛地应用于饮品、甜点等多种食品生产行业。随着全球经济的发展，人们的生活水平也日益提高，营养的摄入量也随之增加，在人群中肥胖症、糖尿病和高血压的发病率也在逐年攀升。通过众多关于甜叶菊的相关药理学研究结果表明，正常人每天摄入适当的甜菊糖苷，对人体不但没有副作用，而且对于治疗这些因营养过剩所致疾病有着辅助治疗的作用[8]。现在，随着人们对于甜叶菊的认可度越来越高，并且美国FDA和欧盟食品安全局已经承认了RA可以作为“第三糖源”，因此培育出高RA含量的甜叶菊新品种将对甜叶菊产业的发展提供很大的推动力[11]。
由于传统育苗存在诸多弊端，常规的甜叶菊育种周期长、消耗大，甜菊糖苷含量准确的测定仅能在花期进行，同时检测效率低下。如果能够探索出一种高效、准确的选育新方法对高RA的甜叶菊育种工作将大大推进。随着对分子生物学研究的不断进展， ESTSSR分子标记也随之兴起，并广泛应用于各种植物的研究。由于EST位于编码区，在一定程度上可以反映基因表达的情况,因此就可以利用SSR引物所得到产物的多态性，利用相关基因分析软件，从而获得可以筛选出研究所需特定性状的SSR引物，在此基础上就可以作为指导作物遗传育种的一种捷径[12]。ESTSSR之所以被广泛应用于分子标记辅助育种，是因为这种标记有着快速、简便并且成本低、重现性好等诸多优点[13]。本实验通过明确甜叶菊EST 序列中 SSR 的总体特点，进而开发与甜叶菊RA密切相关的 ESTSSR 引物，实现在苗期便可初步推断出甜叶菊RA含量的情况，为今后甜叶菊标记辅助育种、品种分类和新品种保护等研究奠定基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1. 1 实验材料、试剂及仪器 2
1．1．1 实验材料 2
1．1．2 实验试剂 2
1．1．3 实验仪器 2
1．2 实验方法 2
1．2．1 甜叶菊采集 2
1．2．2 DNA提取 3
1．2．3 PCR扩增 3
1．2．3．1 PCR扩增前实验准备 3
1．2．3．2 PCR扩增反应体系及反应条件 3
1．2．3．3 PCR产物的电泳分离 4
2 结果与分析 4
2．1 DNA提取结果 4
2．2 PCR反应结果 5
2．2．1 以全池为模板PCR结果 5
2．2．2 以半池为模板PCR结果 6
2．2．3 以单个材料为模板PCR结果 10
2．3 遗传多样性分析 13
2.3.1 三类糖苷含量不同的甜叶菊类群间及个体间的遗传距离和聚类分析 13
2.3.2 甜叶菊遗传多样性分析 15
2.3.3 甜叶菊糖苷含量鉴别用引物 15
3 讨论 16
致谢 16
参考文献 16
图1 甜叶菊基因组DNA 4
图2 以全池为模板PCR结果 5
图3 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
以半池为模板PCR结果（1） 6
图3 以半池为模板PCR结果（2） 6
图3 以半池为模板PCR结果（3） 7
图3以半池为模板PCR结果（4） 7
图4 以半池为模板PAGE结果 9
图5 以单个材料为模板PCR结果（1） 10
图5 以单个材料为模板PCR结果（2） 10
图6 甜叶菊基因组DNA重提结果 11
图7 重提DNA的PCR结果 11
图8 4号引物以单个材料为模板PCR反应后PAGE电泳结果 12
图9 20号引物以单个材料为模板PCR反应后PAGE电泳结果 12
图10 58号引物以单个材料为模板PCR反应后PAGE电泳结果 12
图11 68号引物以单个材料为模板PCR反应后PAGE电泳结果 13
图12 三大群体聚类 14
图13 23个个体聚类 14
图14 31号引物以单个材料为模板PCR结果 15
图19 31号引物以单个材料为模板PAGE电泳结果 15
表1 甜叶菊中糖苷含量情况 3
表2 8%聚丙烯酰胺凝胶配方 4
表3 DNA浓度 5
表4 具有多态性的19对ESTSSR引物详细信息 8
表5 以半池为模板所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳的遗传相似系数和遗传距离 13
表6 以半池为模板所得PCR产物经PAGE电泳的遗传相似系数和遗传距离 13
表7 以个体为模板所得PCR产物经PAGE电泳的总体遗传相似系数和遗传距离 13
表8 甜叶菊遗传多样性 15
高RA甜叶菊辅助选择育种ESTSSR分子标记开发
引言
甜叶菊（S. rebaudiana）原产地并非中国，而是巴拉圭，因此甜叶菊产业在中国起步较晚。甜叶菊作为一种以叶片为主要经济来源的农作物，属于菊科草本植物[1]，并且多年生，因此可以产生较好的经济效益。甜叶菊成为目前主要经济作物的原因是在其体内含有多种糖苷。据相关报道称，到目前为止，就已经在其叶片中检测到四十多种甜菊糖苷[24]。甜叶菊中的糖苷种类众多，但并非每一种都可以用于商品生产，由于糖苷的结构不同，人们对其味觉上的感知也会有所不同，甜叶菊中的糖苷以莱鲍迪苷A（RA）和甜菊苷（STV）为主[56]，就这两种糖苷而言，STV在入口过后，往往伴随着后苦味，而RA口感纯正，跟蔗糖口味比较接近[9]。甜菊糖苷的应用之所以越来越广，是因为它有着高甜度低热量的优良特性，以甜菊苷为例，与蔗糖相比，其甜度高出蔗糖300倍，而蔗糖的热量却高出甜菊苷的300倍，如此大的悬殊造就了甜菊糖苷作为一种甜味添加剂的优良特性，并且甜菊糖苷也日益广泛地应用于饮品、甜点等多种食品生产行业。随着全球经济的发展，人们的生活水平也日益提高，营养的摄入量也随之增加，在人群中肥胖症、糖尿病和高血压的发病率也在逐年攀升。通过众多关于甜叶菊的相关药理学研究结果表明，正常人每天摄入适当的甜菊糖苷，对人体不但没有副作用，而且对于治疗这些因营养过剩所致疾病有着辅助治疗的作用[8]。现在，随着人们对于甜叶菊的认可度越来越高，并且美国FDA和欧盟食品安全局已经承认了RA可以作为“第三糖源”，因此培育出高RA含量的甜叶菊新品种将对甜叶菊产业的发展提供很大的推动力[11]。
由于传统育苗存在诸多弊端，常规的甜叶菊育种周期长、消耗大，甜菊糖苷含量准确的测定仅能在花期进行，同时检测效率低下。如果能够探索出一种高效、准确的选育新方法对高RA的甜叶菊育种工作将大大推进。随着对分子生物学研究的不断进展， ESTSSR分子标记也随之兴起，并广泛应用于各种植物的研究。由于EST位于编码区，在一定程度上可以反映基因表达的情况,因此就可以利用SSR引物所得到产物的多态性，利用相关基因分析软件，从而获得可以筛选出研究所需特定性状的SSR引物，在此基础上就可以作为指导作物遗传育种的一种捷径[12]。ESTSSR之所以被广泛应用于分子标记辅助育种，是因为这种标记有着快速、简便并且成本低、重现性好等诸多优点[13]。本实验通过明确甜叶菊EST 序列中 SSR 的总体特点，进而开发与甜叶菊RA密切相关的 ESTSSR 引物，实现在苗期便可初步推断出甜叶菊RA含量的情况，为今后甜叶菊标记辅助育种、品种分类和新品种保护等研究奠定基础。
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