白及假鳞茎内生菌分离与鉴定
摘要：为了解白及假鳞茎内生真菌群落组成及物种多样性，对采自南京市中山植物园的白及的假鳞茎进行内生真菌分离。通过内生真菌常规分离纯化法分离内生菌，以确定75%乙醇和2% NaClO的最佳表面消毒时间，并结合形态学方法和rDNA-ITS技术对分离菌株进行种属鉴定。结果显示白及假鳞茎用75%乙醇及2% NaClO的最佳表面消毒时间为5min、3min。从白及假鳞茎中共分离得7株内生真菌，分属于6纲、6目、6科、6属。以上的结果表明，白及假鳞茎内生菌种类复杂，分布广泛。
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1材料与仪器 2
1.1.2 真菌通用引物序列2
1.2 方法 2
1.2.1 假鳞茎的预处理 2
1.2.2 假鳞茎的处理与接种 2
1.2.3 分离后真菌的纯化与保存 2
1.3 真菌的形态鉴别2
1.4 DNA提取方法3
1.5 DNA样品检验3
1.6 PCR反应与结果分析 3
1.7 DNA检测 3
2 结果与分析 3
2.1 PCR图谱及其聚类分析 3
2.2内生真菌鉴定结果 3
2.2.1镰刀菌属3
2.2.2 裂褶菌属4
2.2.3 子囊菌属4
2.2.4 丝核菌属4
2.2.5 格孢腔菌目4
2.2.6青霉属4
3讨论4
3.1 兰科植物白及内生真菌研究 4
3.2 白及内生菌分离纯化 4
3.3 白及内生菌显微及分子生物学鉴别4
致谢5
参考文献5
附录6 白及假鳞茎内生菌分离及鉴定
引言
兰科(Ocrhidaecae)是一个除菊科植物外的最兴盛复杂的广布于全球的大科[1]，据统计目前有800余属，25000余种，属于系统演化上进化最高级的类群[2]。兰科植物种子
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
细小如粉，无子叶和胚乳，萌发率极小，在可以进行光合作用之前，不能为种子萌发提供足够的营养，自然条件下兰科植物萌发需与适宜的菌根真菌共生[3]，真菌在原球茎分化成幼苗的过程中也起着中药的作用。自然状态下，只有与特定的真菌形成共生关系，兰科植物种子才能萌发并生长为健康的成年植株[4]。Ressiek[5]最早发现菌丝体存在于鸟巢兰根内，之后不断有对于真菌与兰科植物共生的研究。因兰科植物有较高的经济价值以及与真菌特殊的生物学关系，已经成为近年来研究植物与真菌互作关系、真菌多样性和专一性的重要材料[6]。唐德华[7]在对兰科植物天麻的研究中发现天麻生长过程中，营养不能被其自身吸收，必须依靠蜜环菌侵入体内为其提供营养。白及(Bletilla Striata (Thunb.) Reichb. F.) 是兰科植物白及的干燥块茎，也称“白芨”，《中国药典》（2015版）记载了白及有收敛止血，消肿生肌的疗效。可用于咯血，吐血，外伤出血，疮疡肿毒，皮肤皲裂[8]。目前由于过度开发资源缺乏，其产量很难满足产业的需求[9]，已被列入《濒危野生动植物国际贸易公约》中。因而随着近年来对白及内生菌的研究的不断深入，从形态学和分子学的角度鉴定出内生菌的种类，并进行分析和纯化，找出影响白及种子萌发和植物生长的优势菌种，对开展内生真菌的分子检测和鉴定工作，提升药用植物内生真菌多样性的研究水平，以及白及种子萌发和大田生产极为重要[10]。对白及内生菌的分离和鉴定即是对白及的抗性实验，为种子萌发，组培苗的大田生产提供依据，对其资源的保护和开发利用尤为重要。
内生真菌(Endophytic fungi）是指在其生活史中某一段时期内或整个生命时期生活于植物组织内部，对宿主不引起明显疾病症状的一类真菌[11]。内生真菌普遍存在于植物体内[12]，在长期的生态系统演化过程中，内生真菌与寄主植物之间逐渐形成互惠共生关系。近年来真菌与植物的共生关系引起了科学家的关注，植物内生真菌的鉴定和多样性分析也随之成为该领域内的研究热点[13]。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1材料与仪器
供试植物：白及（经汤兴利讲师鉴定为白及）；取材地点：江苏省南京市中山植物园。
培养基：PDA培养基（马铃薯300g、无水葡萄糖10g、琼脂20g、自然PH、加蒸馏水至1000ml）。
仪器：MJX霉菌培养箱（宁波江南仪器厂），LongGenePCR扩增仪（上海培青科技），TG16WS台式高速离心机（湖南湘仪），DYY8c稳压稳流电泳仪（上海越磁电子科技），HS800D恒温水槽（安庆晟瑞实验仪器），LP502A电子天平（上海亚津电子科技），PYXDHS50×65隔水式电热恒温培养箱（翼博凡实验仪器），SPX15085HⅡ生化培养箱（上海跃进实验仪器），OLYMPUSCX41显微镜，佳能相机等。
1.1.2 真菌通用引物序列[14]
ITS1: 5’TCC GTA GCT GAA CCT GCG G3’；ITS4：5’TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC3’。
1.2 方法
1.2.1 假鳞茎的预处理
选择新鲜健康的白及假鳞茎，仔细去除土壤颗粒和附着物，用自来水持续冲洗表面，洗净后备用。
1.2.2 假鳞茎的处理与接种
假鳞茎的切片消毒处理，在超净工作台上用无菌刀切除其表皮后，切成厚薄适当的切片，用75%乙醇浸泡5min，2%NaClO浸泡3min，再用75%乙醇浸泡5min后，立即用无菌水洗涤3~5次使灭菌液无残留[15]，用灭菌的滤纸吸干切片表面的无菌水。
洗涤后的块根切片分别进行以下两种培养法。（1）组织块培养法：将切片接种于平板内，每个平板接种2~3个。（2）涂布培养法：取切片适量，放入灭菌后的研钵中加无菌水，研碎，取其悬液，离心，取其上清液，稀释，做4个梯度，浓度比为1：10。在无菌的条件下，每个梯度取100~200μL用无菌的涂布器涂于PDA培养基上[16]，温度25℃、湿度25%条件下培养。空白对照：最后一次洗涤无菌水涂布于平板做对照。
1.2.3 分离后真菌的纯化与保存
平板上长出真菌后，根据菌落的大小、生长速度、形态及颜色，将菌分离、纯化。用竹签挑取最外侧菌丝接种于新鲜的 PDA培养基上，在25 ℃下进行纯化培养，得到菌落形态完全一致的单菌落即为纯化的内生真菌。将纯化后的单一菌落进行编号，接种于 PDA平板，培养箱保存备用。
1.3 真菌的形态鉴别
将真菌根据形态学特征需要进行归纳整理。菌种经标准培养条件培养后，观察并记录平板菌落培养特征，包括菌落直径、菌落颜色、菌落质地、菌落反面颜色、分泌物的有无等。挑取菌体制作显微形态观察切片，于普通光学显微镜下观察，记录菌种的显微形态，包括分生孢子头、隔膜、菌丝、分生孢子等。
1.4 DNA提取方法
CTAB法[17]：取适量菌体，加液氮研磨，称取200mg研磨后菌体粉末于2ml离心管中，加入800μl 3%CTAB提取缓冲液；65℃水浴加热45min~60min，每十分钟摇匀一次；取上清液转移到新离心管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，12000r/min，离心10min；取上清液于1.5ml离心管中，加等体积的异丙醇，12000r/min，离心10min；收集沉淀，加800μl乙醇漂洗，12000r/min，离心5min，去上清，重复一次；置烘干箱烘干4h后，加20~25μl无菌水溶解DNA，置于冰箱冷藏备用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1材料与仪器 2
1.1.2 真菌通用引物序列2
1.2 方法 2
1.2.1 假鳞茎的预处理 2
1.2.2 假鳞茎的处理与接种 2
1.2.3 分离后真菌的纯化与保存 2
1.3 真菌的形态鉴别2
1.4 DNA提取方法3
1.5 DNA样品检验3
1.6 PCR反应与结果分析 3
1.7 DNA检测 3
2 结果与分析 3
2.1 PCR图谱及其聚类分析 3
2.2内生真菌鉴定结果 3
2.2.1镰刀菌属3
2.2.2 裂褶菌属4
2.2.3 子囊菌属4
2.2.4 丝核菌属4
2.2.5 格孢腔菌目4
2.2.6青霉属4
3讨论4
3.1 兰科植物白及内生真菌研究 4
3.2 白及内生菌分离纯化 4
3.3 白及内生菌显微及分子生物学鉴别4
致谢5
参考文献5
附录6 白及假鳞茎内生菌分离及鉴定
引言
兰科(Ocrhidaecae)是一个除菊科植物外的最兴盛复杂的广布于全球的大科[1]，据统计目前有800余属，25000余种，属于系统演化上进化最高级的类群[2]。兰科植物种子
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
细小如粉，无子叶和胚乳，萌发率极小，在可以进行光合作用之前，不能为种子萌发提供足够的营养，自然条件下兰科植物萌发需与适宜的菌根真菌共生[3]，真菌在原球茎分化成幼苗的过程中也起着中药的作用。自然状态下，只有与特定的真菌形成共生关系，兰科植物种子才能萌发并生长为健康的成年植株[4]。Ressiek[5]最早发现菌丝体存在于鸟巢兰根内，之后不断有对于真菌与兰科植物共生的研究。因兰科植物有较高的经济价值以及与真菌特殊的生物学关系，已经成为近年来研究植物与真菌互作关系、真菌多样性和专一性的重要材料[6]。唐德华[7]在对兰科植物天麻的研究中发现天麻生长过程中，营养不能被其自身吸收，必须依靠蜜环菌侵入体内为其提供营养。白及(Bletilla Striata (Thunb.) Reichb. F.) 是兰科植物白及的干燥块茎，也称“白芨”，《中国药典》（2015版）记载了白及有收敛止血，消肿生肌的疗效。可用于咯血，吐血，外伤出血，疮疡肿毒，皮肤皲裂[8]。目前由于过度开发资源缺乏，其产量很难满足产业的需求[9]，已被列入《濒危野生动植物国际贸易公约》中。因而随着近年来对白及内生菌的研究的不断深入，从形态学和分子学的角度鉴定出内生菌的种类，并进行分析和纯化，找出影响白及种子萌发和植物生长的优势菌种，对开展内生真菌的分子检测和鉴定工作，提升药用植物内生真菌多样性的研究水平，以及白及种子萌发和大田生产极为重要[10]。对白及内生菌的分离和鉴定即是对白及的抗性实验，为种子萌发，组培苗的大田生产提供依据，对其资源的保护和开发利用尤为重要。
内生真菌(Endophytic fungi）是指在其生活史中某一段时期内或整个生命时期生活于植物组织内部，对宿主不引起明显疾病症状的一类真菌[11]。内生真菌普遍存在于植物体内[12]，在长期的生态系统演化过程中，内生真菌与寄主植物之间逐渐形成互惠共生关系。近年来真菌与植物的共生关系引起了科学家的关注，植物内生真菌的鉴定和多样性分析也随之成为该领域内的研究热点[13]。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1材料与仪器
供试植物：白及（经汤兴利讲师鉴定为白及）；取材地点：江苏省南京市中山植物园。
培养基：PDA培养基（马铃薯300g、无水葡萄糖10g、琼脂20g、自然PH、加蒸馏水至1000ml）。
仪器：MJX霉菌培养箱（宁波江南仪器厂），LongGenePCR扩增仪（上海培青科技），TG16WS台式高速离心机（湖南湘仪），DYY8c稳压稳流电泳仪（上海越磁电子科技），HS800D恒温水槽（安庆晟瑞实验仪器），LP502A电子天平（上海亚津电子科技），PYXDHS50×65隔水式电热恒温培养箱（翼博凡实验仪器），SPX15085HⅡ生化培养箱（上海跃进实验仪器），OLYMPUSCX41显微镜，佳能相机等。
1.1.2 真菌通用引物序列[14]
ITS1: 5’TCC GTA GCT GAA CCT GCG G3’；ITS4：5’TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC3’。
1.2 方法
1.2.1 假鳞茎的预处理
选择新鲜健康的白及假鳞茎，仔细去除土壤颗粒和附着物，用自来水持续冲洗表面，洗净后备用。
1.2.2 假鳞茎的处理与接种
假鳞茎的切片消毒处理，在超净工作台上用无菌刀切除其表皮后，切成厚薄适当的切片，用75%乙醇浸泡5min，2%NaClO浸泡3min，再用75%乙醇浸泡5min后，立即用无菌水洗涤3~5次使灭菌液无残留[15]，用灭菌的滤纸吸干切片表面的无菌水。
洗涤后的块根切片分别进行以下两种培养法。（1）组织块培养法：将切片接种于平板内，每个平板接种2~3个。（2）涂布培养法：取切片适量，放入灭菌后的研钵中加无菌水，研碎，取其悬液，离心，取其上清液，稀释，做4个梯度，浓度比为1：10。在无菌的条件下，每个梯度取100~200μL用无菌的涂布器涂于PDA培养基上[16]，温度25℃、湿度25%条件下培养。空白对照：最后一次洗涤无菌水涂布于平板做对照。
1.2.3 分离后真菌的纯化与保存
平板上长出真菌后，根据菌落的大小、生长速度、形态及颜色，将菌分离、纯化。用竹签挑取最外侧菌丝接种于新鲜的 PDA培养基上，在25 ℃下进行纯化培养，得到菌落形态完全一致的单菌落即为纯化的内生真菌。将纯化后的单一菌落进行编号，接种于 PDA平板，培养箱保存备用。
1.3 真菌的形态鉴别
将真菌根据形态学特征需要进行归纳整理。菌种经标准培养条件培养后，观察并记录平板菌落培养特征，包括菌落直径、菌落颜色、菌落质地、菌落反面颜色、分泌物的有无等。挑取菌体制作显微形态观察切片，于普通光学显微镜下观察，记录菌种的显微形态，包括分生孢子头、隔膜、菌丝、分生孢子等。
1.4 DNA提取方法
CTAB法[17]：取适量菌体，加液氮研磨，称取200mg研磨后菌体粉末于2ml离心管中，加入800μl 3%CTAB提取缓冲液；65℃水浴加热45min~60min，每十分钟摇匀一次；取上清液转移到新离心管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，12000r/min，离心10min；取上清液于1.5ml离心管中，加等体积的异丙醇，12000r/min，离心10min；收集沉淀，加800μl乙醇漂洗，12000r/min，离心5min，去上清，重复一次；置烘干箱烘干4h后，加20~25μl无菌水溶解DNA，置于冰箱冷藏备用。
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