秦岭龙胆总黄酮的提取及抗氧化研究(附件)
摘 要秦岭龙胆为龙胆科龙胆属植物(Gentiana apiata N. E. Brown)的干燥根茎，是陕西秦岭特有中草药，具有较好的活血调经作用，有资料表明，其主要物质基础为黄酮类化合物。本实验通过单因素实验探讨了液料比、超声时间、超声温度、超声频率对秦岭龙胆总黄酮得率的影响，然后再通过响应面分析对超声提取提取秦岭龙胆总黄酮的最佳工艺条件进行优化，在最佳工艺的验证下，最终得到一个合理的提取工艺得出其最佳提取条件为超声温度60℃、超声时间20min、料液比为1:25g/ml，超声频率为80kHz。在该条件下的响应面模型测得的总黄酮提取率为2.25%。，秦岭龙胆总黄酮得率达2.29%。秦岭龙胆的抗氧化实验表明，发现秦岭龙胆提取物总黄酮有很好的抗氧化作用，对DPPH和羟基自由基(?OH)都有较好的清除能力。本课题的开展及后期成果的取得，对于进一步合理利用、开发秦岭龙胆资源具有重要的意义，对于地方经济的发展也具有一定的促进作用。
目 录
1 绪论 1
1.1研究背景及意义 1
1.2秦岭龙胆简介 1
1.2.1原植物形态 1
1.2.2生药性状 2
1.2.3研究现状及发展趋势 2
1.3黄酮类化合物常用提取方法介绍 3
1.3.1溶剂提取法 3
1.3.2超声波提取法 3
1.3.3微波辅助提取法 3
1.3.4超临界流体萃取技术 4
1.3.5酶解法 4
1.3.6双水项萃取法 4
1.4.2 羟自由基清除法 5
2 总黄酮的提取工艺研究 8
2.1 仪器与试药 8
2.1.1 试药 8
2.1.2 实验仪器与设备 8
2.2方法学的确定 8
2.2.1溶液的配制 8
2.2.2秦岭龙胆总黄酮得率的计算 9
2.3单因素实验 10
2.3.1 料液比对秦岭龙胆总黄酮提取率的影响 10
2.3.2 超声时间对秦岭龙胆总黄酮提取率的影响 10
2.3.3 超声温度对秦岭龙胆总黄酮提取率的影响 11
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2.3.4 超声频率对秦岭龙胆总黄酮提取率的影响 12
2.4 响应面法对提取秦岭龙胆工艺参数的优化与验证 12
2.4.1 响应面分析因素及水平设定 12
2.4.2实验性验证 17
2.5小结 17
3.1 仪器与试药 18
3.1.1 试药 18
3.1.2实验仪器与设备 18
3.2供试品的制备 18
3.2.1秦岭龙胆总黄酮的制备 18
3.2.2DPPH自由基溶液的配置 18
3.2.3对羟基（?OH）的清除作用 19
3.2实验方法及结果 19
3.2.1 DPPH清除率的测定方法 19
3.2.2羟基自由基(OH)清除率的测定法 19
3.2.3数据处理 20
3.3抗氧化实验结果 20
结论 22
参考文献 24
致 谢 26
1 绪论
1.1研究背景及意义
秦岭龙胆为龙胆科龙胆属植物(Gentiana apiata N. E. Brown)的干燥根茎，别名茱苓草，是陕西秦岭特有中草药。其药性苦、平，归肝、胆、膀胱经。有调经活血，清热明目，利小便的功效，主治月经不调，痛经，头晕失眠，小便不利，淋症，崩漏，白带，痢疾，腹痛[1]。
本课题以秦岭龙胆总黄酮为指标，对其提取工艺进行优化设计，采用单因素试验结合BoxBehnken响应面法[2]，研究各因素及其相互作用对秦岭龙胆总黄酮提取率的影响。并以维生素C(VC）为对照，采用分光光度法[3]，通过两种不同体系对秦岭龙胆总黄酮的体外抗氧化活性进行研究，比较各成分的抗氧化能力强弱。本课题的研究成果为秦岭龙胆资源的开发利用奠定了理论基础,为机体抗衰老及病理上的用药提供临床依据，同时对于地方经济的发展也具有一定的促进作用。
1.2秦岭龙胆简介
1.2.1原植物形态
多年生草本,高20~55cm。根茎斜生,具不明显的节。茎直立,近圆柱形,中空。不育枝的叶全部基生,披针形或狭长圆形,全缘,中脉明显。花枝叶片狭长圆形,尖端钝尖或急尖,全缘,基部连合抱茎。聚伞花序顶生或腋生,常2~3花,稀单生。花黄绿色,具蓝黑色斑点。蒴果卵状椭圆形,种子多数,黄褐色,卵状菱形。花期7~8月,果期8~9月（如图1.1）。
图 1.1 秦岭龙胆原植物形态
1.2.2生药性状
为干燥带根全草，茎圆柱形，黄褐色或褐色，表面具有=细皱纹。叶倒被针形或线状披针形，长2～8cm，宽0.5～1.2cm，先端尖，基部渐狭，主脉明显。花冠钟状褶叠，黄绿色，有深色小点散在，根茎弯曲，黄棕色至深褐色，有横环纹，长2～6cm，直径0.2～0.6cm，质坚硬，不易折断，断面皮部灰棕色，木部黄白色，中央髓部浅褐色，有时中空。根细长，完整者长4～8cm，直径约0.1cm，淡黄棕色至深棕色，平滑或微有细纵纹，质脆易断，断面黄色，气微，味极苦。
图 1.2秦岭龙胆原植物形态
1.2.3研究现状及发展趋势
王宁[4]等通过不同的化学反应对秦岭龙胆进行了初步的定性分析，结果表明其主要含有酚性成分，黄酮及其甙类，香豆素或其甙类，糖、黄酮甙类，生物碱，甾体(植物甾醇)、萜类成分，内酯、鞣质，蛋白质，有机酸，挥发油、油脂类等化学成分，不含强心苷，蒽醌及其苷。李兴科[5]等人采用溶剂提取、硅胶柱层析分离，Sephadex LH20、101大孔树脂纯化等方法，分离得到了荭草甙(Isoorientin)、龙胆苦甙(Gentiopicrin)、秦岭龙胆甙A、秦岭龙胆二糖、蔗糖
(D(+)sucrose)等单体成分。
国内外有关其同属植物龙胆的药理以及临床应用方面有着广泛的研究,但对秦岭龙胆的研究极少，且主要集中在化学成分的初步研究，对其药理及质量标准的研究尚未见报道，其同属植物龙胆的研究及对秦岭龙胆初步的化学成分分析，预示着秦岭龙胆应存在着多方面的药理活性。今后应加强对秦岭龙胆资源的开发研 究，明确其药效物质基础、活性作用机制，建立其药材质量标准，为这一特色资源的开发利用奠定基础。
1.3黄酮类化合物常用提取方法介绍
1.3.1溶剂提取法
黄酮类化合物种类多由于结构和来源不同性质差异很大，需要根据其极性和溶解性。选择不同溶剂进行提取，一般黄酮苷元不溶或难溶于水，易溶于甲醇或乙醇等有机溶剂或稀碱溶液。黄酮苷类易溶于热水、甲醇、乙醇、稀碱溶液。因此常用甲醇、乙醇、水、稀碱溶液作为提取溶剂。如浓度为90%或95%的乙醇提取苷元60%的乙醇提取苷类，热水常提取苷类，秦岭龙胆中总黄酮极性较大所以采取乙醇回流提取，可以溶解于甲醇或乙醇有机溶剂或稀碱溶液中；常采用石油醚除去杂质，乙酸乙酯提取苷。高效简便，易于操作 。所以选取乙醇回流提取秦岭龙胆总黄酮。
目 录
1 绪论 1
1.1研究背景及意义 1
1.2秦岭龙胆简介 1
1.2.1原植物形态 1
1.2.2生药性状 2
1.2.3研究现状及发展趋势 2
1.3黄酮类化合物常用提取方法介绍 3
1.3.1溶剂提取法 3
1.3.2超声波提取法 3
1.3.3微波辅助提取法 3
1.3.4超临界流体萃取技术 4
1.3.5酶解法 4
1.3.6双水项萃取法 4
1.4.2 羟自由基清除法 5
2 总黄酮的提取工艺研究 8
2.1 仪器与试药 8
2.1.1 试药 8
2.1.2 实验仪器与设备 8
2.2方法学的确定 8
2.2.1溶液的配制 8
2.2.2秦岭龙胆总黄酮得率的计算 9
2.3单因素实验 10
2.3.1 料液比对秦岭龙胆总黄酮提取率的影响 10
2.3.2 超声时间对秦岭龙胆总黄酮提取率的影响 10
2.3.3 超声温度对秦岭龙胆总黄酮提取率的影响 11
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2.3.4 超声频率对秦岭龙胆总黄酮提取率的影响 12
2.4 响应面法对提取秦岭龙胆工艺参数的优化与验证 12
2.4.1 响应面分析因素及水平设定 12
2.4.2实验性验证 17
2.5小结 17
3.1 仪器与试药 18
3.1.1 试药 18
3.1.2实验仪器与设备 18
3.2供试品的制备 18
3.2.1秦岭龙胆总黄酮的制备 18
3.2.2DPPH自由基溶液的配置 18
3.2.3对羟基（?OH）的清除作用 19
3.2实验方法及结果 19
3.2.1 DPPH清除率的测定方法 19
3.2.2羟基自由基(OH)清除率的测定法 19
3.2.3数据处理 20
3.3抗氧化实验结果 20
结论 22
参考文献 24
致 谢 26
1 绪论
1.1研究背景及意义
秦岭龙胆为龙胆科龙胆属植物(Gentiana apiata N. E. Brown)的干燥根茎，别名茱苓草，是陕西秦岭特有中草药。其药性苦、平，归肝、胆、膀胱经。有调经活血，清热明目，利小便的功效，主治月经不调，痛经，头晕失眠，小便不利，淋症，崩漏，白带，痢疾，腹痛[1]。
本课题以秦岭龙胆总黄酮为指标，对其提取工艺进行优化设计，采用单因素试验结合BoxBehnken响应面法[2]，研究各因素及其相互作用对秦岭龙胆总黄酮提取率的影响。并以维生素C(VC）为对照，采用分光光度法[3]，通过两种不同体系对秦岭龙胆总黄酮的体外抗氧化活性进行研究，比较各成分的抗氧化能力强弱。本课题的研究成果为秦岭龙胆资源的开发利用奠定了理论基础,为机体抗衰老及病理上的用药提供临床依据，同时对于地方经济的发展也具有一定的促进作用。
1.2秦岭龙胆简介
1.2.1原植物形态
多年生草本,高20~55cm。根茎斜生,具不明显的节。茎直立,近圆柱形,中空。不育枝的叶全部基生,披针形或狭长圆形,全缘,中脉明显。花枝叶片狭长圆形,尖端钝尖或急尖,全缘,基部连合抱茎。聚伞花序顶生或腋生,常2~3花,稀单生。花黄绿色,具蓝黑色斑点。蒴果卵状椭圆形,种子多数,黄褐色,卵状菱形。花期7~8月,果期8~9月（如图1.1）。
图 1.1 秦岭龙胆原植物形态
1.2.2生药性状
为干燥带根全草，茎圆柱形，黄褐色或褐色，表面具有=细皱纹。叶倒被针形或线状披针形，长2～8cm，宽0.5～1.2cm，先端尖，基部渐狭，主脉明显。花冠钟状褶叠，黄绿色，有深色小点散在，根茎弯曲，黄棕色至深褐色，有横环纹，长2～6cm，直径0.2～0.6cm，质坚硬，不易折断，断面皮部灰棕色，木部黄白色，中央髓部浅褐色，有时中空。根细长，完整者长4～8cm，直径约0.1cm，淡黄棕色至深棕色，平滑或微有细纵纹，质脆易断，断面黄色，气微，味极苦。
图 1.2秦岭龙胆原植物形态
1.2.3研究现状及发展趋势
王宁[4]等通过不同的化学反应对秦岭龙胆进行了初步的定性分析，结果表明其主要含有酚性成分，黄酮及其甙类，香豆素或其甙类，糖、黄酮甙类，生物碱，甾体(植物甾醇)、萜类成分，内酯、鞣质，蛋白质，有机酸，挥发油、油脂类等化学成分，不含强心苷，蒽醌及其苷。李兴科[5]等人采用溶剂提取、硅胶柱层析分离，Sephadex LH20、101大孔树脂纯化等方法，分离得到了荭草甙(Isoorientin)、龙胆苦甙(Gentiopicrin)、秦岭龙胆甙A、秦岭龙胆二糖、蔗糖
(D(+)sucrose)等单体成分。
国内外有关其同属植物龙胆的药理以及临床应用方面有着广泛的研究,但对秦岭龙胆的研究极少，且主要集中在化学成分的初步研究，对其药理及质量标准的研究尚未见报道，其同属植物龙胆的研究及对秦岭龙胆初步的化学成分分析，预示着秦岭龙胆应存在着多方面的药理活性。今后应加强对秦岭龙胆资源的开发研 究，明确其药效物质基础、活性作用机制，建立其药材质量标准，为这一特色资源的开发利用奠定基础。
1.3黄酮类化合物常用提取方法介绍
1.3.1溶剂提取法
黄酮类化合物种类多由于结构和来源不同性质差异很大，需要根据其极性和溶解性。选择不同溶剂进行提取，一般黄酮苷元不溶或难溶于水，易溶于甲醇或乙醇等有机溶剂或稀碱溶液。黄酮苷类易溶于热水、甲醇、乙醇、稀碱溶液。因此常用甲醇、乙醇、水、稀碱溶液作为提取溶剂。如浓度为90%或95%的乙醇提取苷元60%的乙醇提取苷类，热水常提取苷类，秦岭龙胆中总黄酮极性较大所以采取乙醇回流提取，可以溶解于甲醇或乙醇有机溶剂或稀碱溶液中；常采用石油醚除去杂质，乙酸乙酯提取苷。高效简便，易于操作 。所以选取乙醇回流提取秦岭龙胆总黄酮。
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