响应曲面优化绞股蓝中总皂苷的提取工艺研究(附件)
摘 要通过对绞股蓝中总皂苷提取工艺研究，为合理有效提取绞股蓝总皂苷大生产提供科学依据。本文结合单因素试验的基本方法和特点对绞股蓝中总皂苷的提取工艺进行深入研究。利用响应面分析法对提取工艺进行优化，优选出最佳的提取工艺参数，为市场上绞股蓝中总皂苷的研究提供理论依据和工业化生产奠定基础。在单因素试验的基础上，选取甲醇浓度、提取时间、液料比3个因素为响应值，利用响应面法研究各自变量交互作用及对绞股蓝中总皂苷提取率的影响，模拟得到二次多项式回归方程的预测模型。结果表明提取工艺的最佳组合为甲醇浓度100%、提取时间100min、料液比12倍时，总1皂苷的提取率最大可以达到13.76%。
Keywords: gynostemma; Total saponins; Extraction process; The response surface. Prediction model 目 录
1绪论 1
1.1绞股蓝的历史和资源 1
1.2绞股蓝的药理作用 2
1.3.绞股蓝的化学成分 3
1.4绞股蓝总皂苷的提取方法和工艺研究 4
2实验部分 6
2.1仪器与材料 6
2.1.1仪器 6
2.1.2药材及试剂 6
2.1.3药材处理 6
2.2实验方法及结果 6
2.2.3供试品溶液的制备 7
2.2.4线性关系的考察 7
2.2.5单因素考察 8
2.2.6响应面试验及结果分析 16
2.3讨论 21
结语 22
参考文献 23
致谢 25
1绪论
1.1绞股蓝的历史和资源
1.11绞股蓝发展历史研究
绞股蓝，是我国传统的中草药，又称天堂草、福音草、超人参、公罗锅底、遍地生根、七叶胆、五叶参、七叶参、小苦药等。其为葫芦科多年生草质藤本植物,民间用于强身益寿的历史源远流长。明代《救荒本草》曾予记载,“饥馑岁月绞股蓝可以充饥”。明代的《农政全书》、《本草纲目》,清代的《植物名实图考》,现代的《全国中草药汇编》、《中药大辞典》、《实用中药手册》、《中草药 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
彩色图谱》等书籍,均有记载[1]。国内外研究结果证明:绞股蓝含有84种皂甙,18种氨基酸、19种微量元素,如对人体有价值的铁、钙、锌、钾、镁、铜、硒、锰等还有人体必需的多种维生素[2]。在我国主要生长种植于陕西省平利县、甘肃省康县、湖南省邵东县、湖北省恩施孝感市，因为盛产南方且含有人参皂苷被誉为“南方人参”和“第二人参”。种植及野生于长江以南的绞股蓝药用含量及使用价值较高，人们称它为延年益寿的的“长寿药草”。1986年，国家科委首次实施的“星火计划”，把绞股蓝名列为有待利用开发的的“名贵中药材”之首，并于2002年3月5日国家卫生部，国家将其列入保健品名单，亦有企业将其加工成绞股蓝茶销售，有良好的经济价值[3]。近年报道陕南平利县,是绞股蓝自然分布分化中心,2004年获得国家原产地保护殊荣,有"中国绞股蓝第一县"之称,20世纪80年代初开始人工种植绞股蓝,先后开发了绞股蓝皂甙粉、绞股蓝茶、绞股蓝饮品等系列产品。近年来随着人们生活质量的不断提高和当地乡村旅游的蓬勃发展[4]
1.1.2绞股蓝种质资源概况
绞股蓝在我国的分布比较广泛，但由于不合理开发、过量采摘及生境破坏以至于种质受到威胁,因此国家林业局保护司已经把绞股蓝列为国家二级保护植物。庞敏[5]指出开展绞股蓝种质资源研究是进行有效资源保护以及绞股蓝品种选育、遗传理论研究、生物技术研究和农业生产的重要物质基础，制定统一的绞股蓝种质资源规范标准,有利于整合全国绞股蓝种质资源,规范绞股蓝种质资源的收集、整理和保存等基础性工作,创造良好的资源和信息共享环境及条件;有利于有效地保护和高效地利用绞股蓝种质资源,充分挖掘其潜在的药用、经济、社会和生态价值促进全国绞股蓝种质资源研究工作的有序、高效发展。靳冰[6]对河南省绞股蓝资源分布及利用情况进行调查,并提出相应的保护建议和措施,为绞股蓝资源的可持 续保护和合理开发利用提供依据。绞股蓝喜阴蔽、湿润环境,野生绞股蓝多生长在近山和低丘一带的人造林和次生林中。上层覆盖度约50%～80%,中层有灌木作支柱和攀援,在通风透光条件下生长良好。土壤以含腐殖质丰富的壤土、砂壤土为好,含水量25%～40%,pH值为6～7.5的土壤均适宜生长[7]。
1.2绞股蓝的药理作用
1.2.1抗肿瘤作用
绞股蓝皂苷有明显的体内外抗肿瘤作用，其直接的细胞毒作用可抑制肿瘤细胞的生长繁殖。张若青[8]研究表明绞股蓝总皂苷对胃癌、直肠癌、子宫癌、食管癌及胆、胰、肾、肺、肝、舌、胆癌及肉瘤等均有效。也有学者指出GypIII、X以及其他一些在C21、C21上有游离羟基的皂苷,对体外培养的黑色素肿瘤细胞（B16）、子宫颈癌细（HeLaS3）、肺癌细胞（3LL)以及肝癌细胞（MH1C1）具有明显的抑制作用，抑制率在20%～80%,且在2～10ug/ml，随质量浓度增高表现出抑制作用增强，同时对正常细胞增殖无不良影响。体外实验证明Gyp能直接杀伤S180肉瘤细胞[9]。在小鼠Lewis肺癌的实验中，绞股蓝总皂苷具有明显的抑制作用，绞股蓝总皂苷给药后荷瘤小鼠脾淋巴细胞总数明显增加，外周血NK细胞活性明显升高，刺激脾的NK细胞活性也明显升高[10]。
1.2.2保护心脑血管作用
绞股蓝中的黄酮成分主要起到对心脑血管保护作用，有学者研究银蓝通络口服液的组方便是专门针对心脑血管疾病属气虚血 瘀证的。银蓝通络口服液是以银杏叶、绞股蓝、蜂蜜为主要成分用于治疗心脑血管疾病的复方中药口服制剂，用于现代医学疾病中的心血管疾 病如冠心病、心绞痛、慢性心衰、心肌梗死等，脑血管疾病如脑 栓塞、脑出血、脑梗死等在中医辩证上多属气虚血瘀证[11]。研究绞股蓝总黄酮对麻醉开胸犬血流动力学及冠脉血流量的作用,绞股蓝总黄酮可扩张冠脉血管、增加冠脉流量、降低心率和心脏后负荷,心肌耗氧量下降,从而改善心肌的供血供氧,调整心脏血管的顺应性,对心血管系统起到调整和改善作用[12]。
1.2.3降血糖作用
刘海星[13]通过药理实验对患有糖尿病的小鼠进行用不同组分提取的绞股蓝灌胃，不同组别患有糖尿病的小鼠均有疗效，结论表明绞股蓝具有降糖作用。魏守蓉等[14] 研究表明绞股蓝总皂苷对糖尿病大鼠体内外实验结果显示稳定的降糖活性，并且对正常血糖无影响，其降糖机制可能与其刺激胰岛素的释放或促胰岛炎恢复，抑制ɑ2淀粉酶、延缓碳水化合物在小肠的吸收有关。黄萍[15]等报道2型糖尿病肾病患者服用绞股蓝总皂苷后，能明显改善肾功能及降低血脂，从而使患者尿蛋白降低 并保护肾脏。
1.2.4保肝作用
陈亮等人实验研究结果表明绞股蓝总皂苷能有效 减轻CCl4诱导的大鼠肝纤维化肝组织炎症、减少肝组织中胶原 沉积，降低血清中ALT含量、降低肝组织中Hyp的含量；并且能 明显降低大鼠肝组织αSMA、ColⅠ蛋白的阳性表达的面积和强 度，以及显著降低大鼠肝组织TGFβ1、PDGFβR mRNA表达。提示绞股蓝 总皂苷通过抑制肝细胞凋亡进而起到抗肝纤维化的作用[16]。冯琴[17]等学者探究绞股蓝总皂苷药物血清对大鼠原代肝星状细胞活化和转化生长因子ｐ1及其受体通路，得结论为绞股蓝总皂苷药物血清可以抑制大鼠原代肝星状细胞活化。其药理机制是抑制线粒体通路介导的肝细胞凋亡是绞股蓝总皂苷防治ＤＭＮ诱导的大鼠肝纤维化。肖增平[18]研究表明GPS3在细胞水平和动物水平对化学性肝损伤都具有良好的保护作用,是一种具有广泛研究和开发价值的生物活性成分,其肝保护作用机制还有待进一步的研究。
Keywords: gynostemma; Total saponins; Extraction process; The response surface. Prediction model 目 录
1绪论 1
1.1绞股蓝的历史和资源 1
1.2绞股蓝的药理作用 2
1.3.绞股蓝的化学成分 3
1.4绞股蓝总皂苷的提取方法和工艺研究 4
2实验部分 6
2.1仪器与材料 6
2.1.1仪器 6
2.1.2药材及试剂 6
2.1.3药材处理 6
2.2实验方法及结果 6
2.2.3供试品溶液的制备 7
2.2.4线性关系的考察 7
2.2.5单因素考察 8
2.2.6响应面试验及结果分析 16
2.3讨论 21
结语 22
参考文献 23
致谢 25
1绪论
1.1绞股蓝的历史和资源
1.11绞股蓝发展历史研究
绞股蓝，是我国传统的中草药，又称天堂草、福音草、超人参、公罗锅底、遍地生根、七叶胆、五叶参、七叶参、小苦药等。其为葫芦科多年生草质藤本植物,民间用于强身益寿的历史源远流长。明代《救荒本草》曾予记载,“饥馑岁月绞股蓝可以充饥”。明代的《农政全书》、《本草纲目》,清代的《植物名实图考》,现代的《全国中草药汇编》、《中药大辞典》、《实用中药手册》、《中草药 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
彩色图谱》等书籍,均有记载[1]。国内外研究结果证明:绞股蓝含有84种皂甙,18种氨基酸、19种微量元素,如对人体有价值的铁、钙、锌、钾、镁、铜、硒、锰等还有人体必需的多种维生素[2]。在我国主要生长种植于陕西省平利县、甘肃省康县、湖南省邵东县、湖北省恩施孝感市，因为盛产南方且含有人参皂苷被誉为“南方人参”和“第二人参”。种植及野生于长江以南的绞股蓝药用含量及使用价值较高，人们称它为延年益寿的的“长寿药草”。1986年，国家科委首次实施的“星火计划”，把绞股蓝名列为有待利用开发的的“名贵中药材”之首，并于2002年3月5日国家卫生部，国家将其列入保健品名单，亦有企业将其加工成绞股蓝茶销售，有良好的经济价值[3]。近年报道陕南平利县,是绞股蓝自然分布分化中心,2004年获得国家原产地保护殊荣,有"中国绞股蓝第一县"之称,20世纪80年代初开始人工种植绞股蓝,先后开发了绞股蓝皂甙粉、绞股蓝茶、绞股蓝饮品等系列产品。近年来随着人们生活质量的不断提高和当地乡村旅游的蓬勃发展[4]
1.1.2绞股蓝种质资源概况
绞股蓝在我国的分布比较广泛，但由于不合理开发、过量采摘及生境破坏以至于种质受到威胁,因此国家林业局保护司已经把绞股蓝列为国家二级保护植物。庞敏[5]指出开展绞股蓝种质资源研究是进行有效资源保护以及绞股蓝品种选育、遗传理论研究、生物技术研究和农业生产的重要物质基础，制定统一的绞股蓝种质资源规范标准,有利于整合全国绞股蓝种质资源,规范绞股蓝种质资源的收集、整理和保存等基础性工作,创造良好的资源和信息共享环境及条件;有利于有效地保护和高效地利用绞股蓝种质资源,充分挖掘其潜在的药用、经济、社会和生态价值促进全国绞股蓝种质资源研究工作的有序、高效发展。靳冰[6]对河南省绞股蓝资源分布及利用情况进行调查,并提出相应的保护建议和措施,为绞股蓝资源的可持 续保护和合理开发利用提供依据。绞股蓝喜阴蔽、湿润环境,野生绞股蓝多生长在近山和低丘一带的人造林和次生林中。上层覆盖度约50%～80%,中层有灌木作支柱和攀援,在通风透光条件下生长良好。土壤以含腐殖质丰富的壤土、砂壤土为好,含水量25%～40%,pH值为6～7.5的土壤均适宜生长[7]。
1.2绞股蓝的药理作用
1.2.1抗肿瘤作用
绞股蓝皂苷有明显的体内外抗肿瘤作用，其直接的细胞毒作用可抑制肿瘤细胞的生长繁殖。张若青[8]研究表明绞股蓝总皂苷对胃癌、直肠癌、子宫癌、食管癌及胆、胰、肾、肺、肝、舌、胆癌及肉瘤等均有效。也有学者指出GypIII、X以及其他一些在C21、C21上有游离羟基的皂苷,对体外培养的黑色素肿瘤细胞（B16）、子宫颈癌细（HeLaS3）、肺癌细胞（3LL)以及肝癌细胞（MH1C1）具有明显的抑制作用，抑制率在20%～80%,且在2～10ug/ml，随质量浓度增高表现出抑制作用增强，同时对正常细胞增殖无不良影响。体外实验证明Gyp能直接杀伤S180肉瘤细胞[9]。在小鼠Lewis肺癌的实验中，绞股蓝总皂苷具有明显的抑制作用，绞股蓝总皂苷给药后荷瘤小鼠脾淋巴细胞总数明显增加，外周血NK细胞活性明显升高，刺激脾的NK细胞活性也明显升高[10]。
1.2.2保护心脑血管作用
绞股蓝中的黄酮成分主要起到对心脑血管保护作用，有学者研究银蓝通络口服液的组方便是专门针对心脑血管疾病属气虚血 瘀证的。银蓝通络口服液是以银杏叶、绞股蓝、蜂蜜为主要成分用于治疗心脑血管疾病的复方中药口服制剂，用于现代医学疾病中的心血管疾 病如冠心病、心绞痛、慢性心衰、心肌梗死等，脑血管疾病如脑 栓塞、脑出血、脑梗死等在中医辩证上多属气虚血瘀证[11]。研究绞股蓝总黄酮对麻醉开胸犬血流动力学及冠脉血流量的作用,绞股蓝总黄酮可扩张冠脉血管、增加冠脉流量、降低心率和心脏后负荷,心肌耗氧量下降,从而改善心肌的供血供氧,调整心脏血管的顺应性,对心血管系统起到调整和改善作用[12]。
1.2.3降血糖作用
刘海星[13]通过药理实验对患有糖尿病的小鼠进行用不同组分提取的绞股蓝灌胃，不同组别患有糖尿病的小鼠均有疗效，结论表明绞股蓝具有降糖作用。魏守蓉等[14] 研究表明绞股蓝总皂苷对糖尿病大鼠体内外实验结果显示稳定的降糖活性，并且对正常血糖无影响，其降糖机制可能与其刺激胰岛素的释放或促胰岛炎恢复，抑制ɑ2淀粉酶、延缓碳水化合物在小肠的吸收有关。黄萍[15]等报道2型糖尿病肾病患者服用绞股蓝总皂苷后，能明显改善肾功能及降低血脂，从而使患者尿蛋白降低 并保护肾脏。
1.2.4保肝作用
陈亮等人实验研究结果表明绞股蓝总皂苷能有效 减轻CCl4诱导的大鼠肝纤维化肝组织炎症、减少肝组织中胶原 沉积，降低血清中ALT含量、降低肝组织中Hyp的含量；并且能 明显降低大鼠肝组织αSMA、ColⅠ蛋白的阳性表达的面积和强 度，以及显著降低大鼠肝组织TGFβ1、PDGFβR mRNA表达。提示绞股蓝 总皂苷通过抑制肝细胞凋亡进而起到抗肝纤维化的作用[16]。冯琴[17]等学者探究绞股蓝总皂苷药物血清对大鼠原代肝星状细胞活化和转化生长因子ｐ1及其受体通路，得结论为绞股蓝总皂苷药物血清可以抑制大鼠原代肝星状细胞活化。其药理机制是抑制线粒体通路介导的肝细胞凋亡是绞股蓝总皂苷防治ＤＭＮ诱导的大鼠肝纤维化。肖增平[18]研究表明GPS3在细胞水平和动物水平对化学性肝损伤都具有良好的保护作用,是一种具有广泛研究和开发价值的生物活性成分,其肝保护作用机制还有待进一步的研究。
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