光慈姑多糖结构初步分析及其生物活性研究
目的初步探究中药材光慈姑多糖的结构及其抗乳腺癌细胞增殖活性，为进一步探索光慈姑多糖的生物活性及其进一步开发应用提供依据。方法以纯化前后的光慈姑多糖样品为对象，通过MTT法检测光慈姑粗多糖与精多糖的抗乳腺癌细胞MCF-7增殖活性；通过紫外光谱分析（UV）和高效液相凝胶渗透色谱法（HPGPC）鉴定光慈姑精多糖纯度及确定光慈姑多糖分子量；通过扫描电镜观察光慈姑精多糖的表面形态。结果UV表明分离纯化后的光慈姑多糖不含核酸和蛋白质等杂质；HPGPC测得光慈姑多糖平均分子量为36.46 KDa；光慈姑精多糖具有抗乳腺癌增殖细胞活性，且呈现明显的剂量依赖关系，IC50为1.01 mg·mL-1。结论纯化后的光慈姑多糖除含少量糖蛋白外，几乎不含有核酸、蛋白质等杂质，且初步猜测光慈姑多糖可能是抗乳腺癌活性成分。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与设备 2
1.1 材料与试剂 2
1.2 仪器与设备 2
2 实验方法 3
2.1 光慈姑多糖的提取、分离纯化 3
2.1.1 光慈姑多糖提取 3
2.1.2 光慈姑粗多糖的纯化 3
2.2光慈姑多糖纯度鉴定及分子量测定 3
2.2.1紫外光谱分析 3
2.2.2高效液相凝胶渗透色谱法分析 3
2.3光慈姑多糖的扫描电子显微镜观察 3
2.4光慈姑多糖生物活性研究 3
2.4.1 人乳腺癌细胞MCF7的准备 4
2.4.3光慈姑粗多糖与精多糖抗乳腺癌细胞增殖生物活性 4
3 结果与分析 5
3.1光慈姑多糖纯度鉴定及分子量测定 5
3.1.1紫外光谱分析 5
3.1.2高效液相凝胶渗透色谱法分析 5
3.2 光慈姑多糖扫描电子显微镜观察结果 6
3.3光慈姑粗多糖（TEP）与精多糖（TEP1）抗乳腺癌细胞增殖生物活性 6
4讨论与结论 7
致谢 8
参考文献 8
光慈姑多糖结构初步分析及其生物 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
活性研究
引言
中药材光慈姑是百合科郁金香属多年生草本植物老鸦瓣Tulipa edulis (Miq.) Baker的去膜质皮和绒毛后的干燥鳞茎[1]，具有解毒散结、行血化瘀之功效，多用于治疗痢疾、小儿痰厥，痛风等，外可治疔疮疖肿、咽喉肿痛、蛇虫狂犬伤等[2]。目前也是治疗多种癌症的常用药，如咽喉癌、淋巴瘤、乳腺癌等[34]。作为一种中医常用要药，在临床上发挥着重要作用，目前已经发现它在抗癌方面疗效显著，并开发出乳核散结片等中成方制剂。
近年来，虽然国内外学者对中药材光慈姑进行了较为系统的研究，但研究方向主要集中在生物学特性[5,6]、系统分类[7]、栽培生理[8]、组织培养[9,10]、干燥工艺[11]、资源评价[5]、遗传多样性[12]等方面，鲜见对其化学成分及活性、药理学方面的研究。尹艺林等研究发现光慈姑含有淀粉、多糖及秋水仙碱[13]。研究表明中药材光慈姑秋水仙碱含量几乎为痕量水平[14]，而多糖含量则相对丰富[11,13]。目前，已发现多种多糖具有抗肿瘤、调节免疫、促伤口愈合等功效且毒副作用小[15]，多糖具有多种生物活性，如抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂等功效，因此中药材光慈姑多糖可能是其体现抗肿瘤作用的主要活性成分之一。
多糖为多羟基醛或多羟基酮的天然高分子聚合物，广泛存在于动物、植物及微生物中，是基本的生命物质之一。多糖的结构主要包括初级结构（一级结构）和高级结构（二级结构、三级结构和四级结构）。一级结构包括单糖组成、单糖残基构型、糖苷键类型、支链连接位点、支链长度、官能团等。现在的研究主要以多糖的一级结构为主，并且表征的方法较多，主要分为化学分析法、仪器分析法及生物学方法。随着糖化学及糖生物学的快速发展，目前对多糖的研究也愈加广泛及深入。许多研究表明，具有酸性基团的多糖，有提高免疫、抗肿瘤、抗病毒等多种生理活性，如六味地黄酸性多糖[16]、亚麻籽胶酸性多糖[17]等。已有的研究结果显示，多数具有突出生物学活性的葡聚多糖都以（1→3）糖苷键连接。具有肿瘤活性的甘露多糖为（1→6）键型，活性半乳糖则以（1→3）键型连接。有些研究者通过分子修饰的方法，如硫酸酯化、乙酰化、烷基化、磷酸酯化等来改变多糖取代基的种类、数目和位置，从而改变多糖的结构，以提高其生物活性。Tao等[18]在裂褶菌多糖构效关系的研究中发现，抗肿瘤活性较高的裂褶菌多糖呈现三螺旋结构，而单螺旋β葡聚糖虽然具有与其相似的一级结构，但不具备抗肿瘤活性。据此推测光慈姑多糖的抗肿瘤活性与结构息息相关。
本课题组前期优化了光慈姑多糖提取工艺，对精制多糖进行了理化性质、简单结构和抗氧化能力研究，发现光慈姑精制多糖具有一定的抗氧化作用，因此笔者推测光慈姑多糖可能是其重要药效活性成分。此外，光慈姑目前主要应用于乳腺疾病，故开展光慈姑粗多糖与精多糖的抗乳腺癌细胞活性研究，以进一步确定光慈姑多糖的药理作用，并对光慈姑多糖结构进行初步分析，为后续研究光慈姑的生物活性提供依据。
1 材料与设备
1.1 材料与试剂
实验材料：光慈姑材料于2014年5月采集于安徽省阜阳市老鸦瓣种植基地，经大学郭巧生教授鉴定为老鸦瓣Tulipa edulis的鳞茎。人乳腺癌细胞MCF7购自中国科学院上海细胞所。
实验试剂：无水葡萄糖、浓硫酸、石油醚、无水乙醇等试剂均为国产分析纯；三氟乙酸、吡啶、盐酸羟胺、肌醇、乙酸酐均为色谱纯；重水购自南京寿德有限公司；活性炭购自Sigma公司；重蒸酚、乙二胺四乙酸（EDTA）均购自北京索莱宝生物科技有限公司；右旋糖酐系列标准品（分子量分别为4600 Da、7100 Da、10000 Da、21400 Da、41100 Da、84400 Da、138000 Da）
1.2 仪器与设备
电热恒温鼓风干燥箱（XMTD8222型，上海精宏实验设备有限公司）；紫外可见分光光度计（Alpha1506型，上海谱元仪器有限公司）；台式高速冷冻离心机（5810 R型，eppendorf 中国有限公司）；数控超声波清洗器（PS60 A型，东莞市洁康超声波设备有限公司）；恒温水浴锅（HHS型，巩义市苏华仪器有限责任公司）；电子天平（ARA 520型，上海奥豪斯仪器有限公司）；高效液相色谱系统（LC20A型，日本岛津有限公司）；蒸发光检测器（ELSD，日本岛津有限公司）；循环水真空泵（SHZD型，巩义市予华仪器有限责任公司）；回流装置，冷冻干燥机（LGJ12型，北京松源华兴科技发展有限公司），细胞恒温培养箱，超净工作台，倒置显微镜，细胞培养板，酶标仪（美国Biotek公司）；旋转蒸发仪（RE2000 A型，上海亚荣生化仪器厂）；自动电位滴定仪（ZD2型，上海仪电科学仪器股份有限责任公司）；紫外可见分光光度计（Alpha1506型，上海谱元仪器有限公司）；水浴锅（HHS型，巩义市予华仪器有限责任公司）；扫描电子显微镜（S4800型，日本日立公司）
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与设备 2
1.1 材料与试剂 2
1.2 仪器与设备 2
2 实验方法 3
2.1 光慈姑多糖的提取、分离纯化 3
2.1.1 光慈姑多糖提取 3
2.1.2 光慈姑粗多糖的纯化 3
2.2光慈姑多糖纯度鉴定及分子量测定 3
2.2.1紫外光谱分析 3
2.2.2高效液相凝胶渗透色谱法分析 3
2.3光慈姑多糖的扫描电子显微镜观察 3
2.4光慈姑多糖生物活性研究 3
2.4.1 人乳腺癌细胞MCF7的准备 4
2.4.3光慈姑粗多糖与精多糖抗乳腺癌细胞增殖生物活性 4
3 结果与分析 5
3.1光慈姑多糖纯度鉴定及分子量测定 5
3.1.1紫外光谱分析 5
3.1.2高效液相凝胶渗透色谱法分析 5
3.2 光慈姑多糖扫描电子显微镜观察结果 6
3.3光慈姑粗多糖（TEP）与精多糖（TEP1）抗乳腺癌细胞增殖生物活性 6
4讨论与结论 7
致谢 8
参考文献 8
光慈姑多糖结构初步分析及其生物 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
活性研究
引言
中药材光慈姑是百合科郁金香属多年生草本植物老鸦瓣Tulipa edulis (Miq.) Baker的去膜质皮和绒毛后的干燥鳞茎[1]，具有解毒散结、行血化瘀之功效，多用于治疗痢疾、小儿痰厥，痛风等，外可治疔疮疖肿、咽喉肿痛、蛇虫狂犬伤等[2]。目前也是治疗多种癌症的常用药，如咽喉癌、淋巴瘤、乳腺癌等[34]。作为一种中医常用要药，在临床上发挥着重要作用，目前已经发现它在抗癌方面疗效显著，并开发出乳核散结片等中成方制剂。
近年来，虽然国内外学者对中药材光慈姑进行了较为系统的研究，但研究方向主要集中在生物学特性[5,6]、系统分类[7]、栽培生理[8]、组织培养[9,10]、干燥工艺[11]、资源评价[5]、遗传多样性[12]等方面，鲜见对其化学成分及活性、药理学方面的研究。尹艺林等研究发现光慈姑含有淀粉、多糖及秋水仙碱[13]。研究表明中药材光慈姑秋水仙碱含量几乎为痕量水平[14]，而多糖含量则相对丰富[11,13]。目前，已发现多种多糖具有抗肿瘤、调节免疫、促伤口愈合等功效且毒副作用小[15]，多糖具有多种生物活性，如抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂等功效，因此中药材光慈姑多糖可能是其体现抗肿瘤作用的主要活性成分之一。
多糖为多羟基醛或多羟基酮的天然高分子聚合物，广泛存在于动物、植物及微生物中，是基本的生命物质之一。多糖的结构主要包括初级结构（一级结构）和高级结构（二级结构、三级结构和四级结构）。一级结构包括单糖组成、单糖残基构型、糖苷键类型、支链连接位点、支链长度、官能团等。现在的研究主要以多糖的一级结构为主，并且表征的方法较多，主要分为化学分析法、仪器分析法及生物学方法。随着糖化学及糖生物学的快速发展，目前对多糖的研究也愈加广泛及深入。许多研究表明，具有酸性基团的多糖，有提高免疫、抗肿瘤、抗病毒等多种生理活性，如六味地黄酸性多糖[16]、亚麻籽胶酸性多糖[17]等。已有的研究结果显示，多数具有突出生物学活性的葡聚多糖都以（1→3）糖苷键连接。具有肿瘤活性的甘露多糖为（1→6）键型，活性半乳糖则以（1→3）键型连接。有些研究者通过分子修饰的方法，如硫酸酯化、乙酰化、烷基化、磷酸酯化等来改变多糖取代基的种类、数目和位置，从而改变多糖的结构，以提高其生物活性。Tao等[18]在裂褶菌多糖构效关系的研究中发现，抗肿瘤活性较高的裂褶菌多糖呈现三螺旋结构，而单螺旋β葡聚糖虽然具有与其相似的一级结构，但不具备抗肿瘤活性。据此推测光慈姑多糖的抗肿瘤活性与结构息息相关。
本课题组前期优化了光慈姑多糖提取工艺，对精制多糖进行了理化性质、简单结构和抗氧化能力研究，发现光慈姑精制多糖具有一定的抗氧化作用，因此笔者推测光慈姑多糖可能是其重要药效活性成分。此外，光慈姑目前主要应用于乳腺疾病，故开展光慈姑粗多糖与精多糖的抗乳腺癌细胞活性研究，以进一步确定光慈姑多糖的药理作用，并对光慈姑多糖结构进行初步分析，为后续研究光慈姑的生物活性提供依据。
1 材料与设备
1.1 材料与试剂
实验材料：光慈姑材料于2014年5月采集于安徽省阜阳市老鸦瓣种植基地，经大学郭巧生教授鉴定为老鸦瓣Tulipa edulis的鳞茎。人乳腺癌细胞MCF7购自中国科学院上海细胞所。
实验试剂：无水葡萄糖、浓硫酸、石油醚、无水乙醇等试剂均为国产分析纯；三氟乙酸、吡啶、盐酸羟胺、肌醇、乙酸酐均为色谱纯；重水购自南京寿德有限公司；活性炭购自Sigma公司；重蒸酚、乙二胺四乙酸（EDTA）均购自北京索莱宝生物科技有限公司；右旋糖酐系列标准品（分子量分别为4600 Da、7100 Da、10000 Da、21400 Da、41100 Da、84400 Da、138000 Da）
1.2 仪器与设备
电热恒温鼓风干燥箱（XMTD8222型，上海精宏实验设备有限公司）；紫外可见分光光度计（Alpha1506型，上海谱元仪器有限公司）；台式高速冷冻离心机（5810 R型，eppendorf 中国有限公司）；数控超声波清洗器（PS60 A型，东莞市洁康超声波设备有限公司）；恒温水浴锅（HHS型，巩义市苏华仪器有限责任公司）；电子天平（ARA 520型，上海奥豪斯仪器有限公司）；高效液相色谱系统（LC20A型，日本岛津有限公司）；蒸发光检测器（ELSD，日本岛津有限公司）；循环水真空泵（SHZD型，巩义市予华仪器有限责任公司）；回流装置，冷冻干燥机（LGJ12型，北京松源华兴科技发展有限公司），细胞恒温培养箱，超净工作台，倒置显微镜，细胞培养板，酶标仪（美国Biotek公司）；旋转蒸发仪（RE2000 A型，上海亚荣生化仪器厂）；自动电位滴定仪（ZD2型，上海仪电科学仪器股份有限责任公司）；紫外可见分光光度计（Alpha1506型，上海谱元仪器有限公司）；水浴锅（HHS型，巩义市予华仪器有限责任公司）；扫描电子显微镜（S4800型，日本日立公司）
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