菲牛蛭guamerin基因的克隆和吸食对其表达的影响
目的克隆菲牛蛭的Guamerin基因，探究吸食对其表达的影响，同时确定菲牛蛭Guamerin基因的最佳时空表达模式。方法对菲牛蛭的Guamerin基因进行克隆鉴定和测序，通过RT-PCR对Guamerin基因进行定量分析。结果菲牛蛭的各个组织的Guamerin基因相对表达量在吸食的过程中都会出现明显的涨幅，但是各个组织出现的时间段不尽相同。结论吸食对于菲牛蛭体内的Guamerin的基因表达有着促进作用，促进的效果与体内不同的组织和吸食阶段有关。
目录
摘要 3
关键词 3
ABSTRACT 3
KEY WORDS 3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1 试验材料 4
1.2 实验仪器与试剂 4
2 实验方法 4
2.1实验设计 4
2.2引物设计与合成 5
2.3 RNA的提取与鉴定 5
2.4目的基因克隆 5
2.5 Guamerin基因的时空表达分析 7
3 结果与分析 7
3.1菲牛蛭Guamerin基因的生物信息学分析 7
3.2菲牛蛭Guamerin基因同源性分析及构建系统进化树 8
3.3菲牛蛭Guamerin基因表达量特征分析 9
4 讨论 11
致谢 12
参考文献： 12
菲牛蛭Guamerin基因的克隆和吸食对其表达的影响
学生 陈肖竹
引言
引言
菲牛蛭(Poecilobdella manillensis Lesson)俗称金边蚂蟥,别名马尼拟医蛭,在动物分类上隶属于环节动物门(Annelida)、蛭纲(Hirudinea)、无吻蛭目(Arhynchobdellida blanchard)、医蛭科(Hirudinidae whitman)、牛蛭属(Poecilobdella ),是吸血类水蛭中个体较大的品种,生活在稻田、水沟、江河或池塘里,以吸吮人和脊椎动物（如牛、青蛙等）的血液为生，主要分布于我国华南的广西、广东、福建、海南和香港，国外主要分布于菲律宾、印度尼 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
西亚、泰国、越南等[1][2][3]。我国古代医书中有很多用菲牛蛭治疗各种疾病的记载，《神农本草经》记载到“主逐恶血、瘀血、月闭、破血瘕积聚、无子，利水道”[4]；李时珍的《本草纲目》也有提起：“咸走血，苦胜血。水蛭之咸苦，以除蓄血，乃肝经血分药，故能通肝经聚血”[5]；医圣张仲景也曾用其祛邪扶正，治疗“水结”、“瘀血”之症，显示了其独特的疗效，后世张锡纯也有称赞水蛭“存瘀血而不伤新血，纯系水之精华生成，于气分丝毫无损，而血瘀默然于无形，真良药也”。在公元1500年前，埃及人首创出水蛭放血疗法。18世纪末到19世纪，欧洲人甚至迷信菲牛蛭能吮去人体内的病血，不论头痛脑热一概使用菲牛蛭进行吮血治疗，1829~1836 年，仅法国巴黎医院就约有 500~600万人使用过菲牛蛭吸血疗病，每年消耗菲牛蛭约800~5700万条[6]。
Guamerin是一种从水蛭[7]纯化出来的弹性蛋白酶特异性抑制剂，它由57个氨基酸残基组成, 富含半胱氨酸,相对分子质量为6110Da[8]。现有研究表明，Guamerin基因序列与任何已知的蛭类蛋白酶抑制剂没有明显相似性, 而与 Hirustansin 有51%的序列同源性；它的10个半胱氨酸残基序列显示,它与Antistasin属同一类丝氨酸蛋白酶抑制剂[9]。 人白细胞弹性蛋白酶(Human leukocyte elastase,HLE)，是人体受炎症刺激而释放出的一种破坏性丝氨酸蛋白酶。一般情况下，人白细胞弹性蛋白酶的功能活性由于抑制剂的存在而受到有效的控制而保持平衡，当弹性蛋白酶与其生理性抑制剂之间的平衡被破坏，可导致严重的组织损伤，并与多种疾病，如癌症、脓血症、胰腺炎和类风湿关节炎等的发生和发展有密切的联系[10]。因此，弹性蛋白酶抑制剂具有潜在的治疗上述疾病的价值。
吸血蛭在吸食期间，会将大量生物活性物质转移到寄主体内用来阻止伤口过早的止血和急性炎症的发生，促使吸血蛭能顺利吸食血液。目前对吸血蛭的研究主要集中在活性物质的挖掘以及药理作用方面，鲜有吸血蛭吸食阶段关键基因表达的研究。
本实验将克隆菲牛蛭的Guamerin基因，对克隆得到的基因进行同源性分析。并对不同吸食阶段的菲牛蛭的各个组织部位的Guamerin基因通过RTPCR进行定量分析，探究吸食对菲牛蛭Guamerin基因表达的影响，同时确定菲牛蛭Guamerin基因的最佳时空表达模式。
1 材料与方法
1.1 试验材料
实验所用动物菲牛蛭采自广西壮族自治区钦州市黄屋屯镇，经大学郭巧生教授鉴定为医蛭科动物菲牛蛭(Poecilobdella manillensis Lesson)。
1.2 实验仪器与试剂
实时荧光定量PCR仪（美国ABI Step one7500）；PCR仪（PTC200，bioRAD）；电泳仪（DYY6C，北京六一仪器厂）；凝胶成像仪（JS380，上海培清科技有限公司）。RNA提取试剂RNAiso Reagent (Takara) ；反转录试剂盒PrimeScriptTMRT regent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)；DNA高保真聚合酶试剂盒PrimeSTAR Max DNA Polymerase（TaKaRa）；DNA 纯化/回收试剂盒MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0（TaKaRa）；克隆载体 pEASYBunt Cloning Vector （TRANS）；大肠杆菌感受态细胞 Trans1T1 Phage Resistant Competent Cell （TRANS）。胶回收试剂盒和八联管为美国 Axygen 公司产品。引物的合成及扩增产物的序列测定均由上海英潍捷基贸易有限公司完成。
2 实验方法
2.1实验设计
于2015年11月将菲牛蛭入土越冬，于2016年6月产卵结束后，将菲牛蛭暂养至玻璃水箱中一个周后，随机分为6组，第一至六组分别用序号Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ代表吸食前和吸食后1、5、15、30、60天六个处理组，每个处理组取3个重复，每个重复10条菲牛蛭，解剖后分别取各个时期的唾液腺、前吸盘、嗉囊、肌肉和直肠，提取菲牛蛭各时期各组织的总RNA，部分材料暂时不提取的放于80℃环境下保存。
目录
摘要 3
关键词 3
ABSTRACT 3
KEY WORDS 3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1 试验材料 4
1.2 实验仪器与试剂 4
2 实验方法 4
2.1实验设计 4
2.2引物设计与合成 5
2.3 RNA的提取与鉴定 5
2.4目的基因克隆 5
2.5 Guamerin基因的时空表达分析 7
3 结果与分析 7
3.1菲牛蛭Guamerin基因的生物信息学分析 7
3.2菲牛蛭Guamerin基因同源性分析及构建系统进化树 8
3.3菲牛蛭Guamerin基因表达量特征分析 9
4 讨论 11
致谢 12
参考文献： 12
菲牛蛭Guamerin基因的克隆和吸食对其表达的影响
学生 陈肖竹
引言
引言
菲牛蛭(Poecilobdella manillensis Lesson)俗称金边蚂蟥,别名马尼拟医蛭,在动物分类上隶属于环节动物门(Annelida)、蛭纲(Hirudinea)、无吻蛭目(Arhynchobdellida blanchard)、医蛭科(Hirudinidae whitman)、牛蛭属(Poecilobdella ),是吸血类水蛭中个体较大的品种,生活在稻田、水沟、江河或池塘里,以吸吮人和脊椎动物（如牛、青蛙等）的血液为生，主要分布于我国华南的广西、广东、福建、海南和香港，国外主要分布于菲律宾、印度尼 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
西亚、泰国、越南等[1][2][3]。我国古代医书中有很多用菲牛蛭治疗各种疾病的记载，《神农本草经》记载到“主逐恶血、瘀血、月闭、破血瘕积聚、无子，利水道”[4]；李时珍的《本草纲目》也有提起：“咸走血，苦胜血。水蛭之咸苦，以除蓄血，乃肝经血分药，故能通肝经聚血”[5]；医圣张仲景也曾用其祛邪扶正，治疗“水结”、“瘀血”之症，显示了其独特的疗效，后世张锡纯也有称赞水蛭“存瘀血而不伤新血，纯系水之精华生成，于气分丝毫无损，而血瘀默然于无形，真良药也”。在公元1500年前，埃及人首创出水蛭放血疗法。18世纪末到19世纪，欧洲人甚至迷信菲牛蛭能吮去人体内的病血，不论头痛脑热一概使用菲牛蛭进行吮血治疗，1829~1836 年，仅法国巴黎医院就约有 500~600万人使用过菲牛蛭吸血疗病，每年消耗菲牛蛭约800~5700万条[6]。
Guamerin是一种从水蛭[7]纯化出来的弹性蛋白酶特异性抑制剂，它由57个氨基酸残基组成, 富含半胱氨酸,相对分子质量为6110Da[8]。现有研究表明，Guamerin基因序列与任何已知的蛭类蛋白酶抑制剂没有明显相似性, 而与 Hirustansin 有51%的序列同源性；它的10个半胱氨酸残基序列显示,它与Antistasin属同一类丝氨酸蛋白酶抑制剂[9]。 人白细胞弹性蛋白酶(Human leukocyte elastase,HLE)，是人体受炎症刺激而释放出的一种破坏性丝氨酸蛋白酶。一般情况下，人白细胞弹性蛋白酶的功能活性由于抑制剂的存在而受到有效的控制而保持平衡，当弹性蛋白酶与其生理性抑制剂之间的平衡被破坏，可导致严重的组织损伤，并与多种疾病，如癌症、脓血症、胰腺炎和类风湿关节炎等的发生和发展有密切的联系[10]。因此，弹性蛋白酶抑制剂具有潜在的治疗上述疾病的价值。
吸血蛭在吸食期间，会将大量生物活性物质转移到寄主体内用来阻止伤口过早的止血和急性炎症的发生，促使吸血蛭能顺利吸食血液。目前对吸血蛭的研究主要集中在活性物质的挖掘以及药理作用方面，鲜有吸血蛭吸食阶段关键基因表达的研究。
本实验将克隆菲牛蛭的Guamerin基因，对克隆得到的基因进行同源性分析。并对不同吸食阶段的菲牛蛭的各个组织部位的Guamerin基因通过RTPCR进行定量分析，探究吸食对菲牛蛭Guamerin基因表达的影响，同时确定菲牛蛭Guamerin基因的最佳时空表达模式。
1 材料与方法
1.1 试验材料
实验所用动物菲牛蛭采自广西壮族自治区钦州市黄屋屯镇，经大学郭巧生教授鉴定为医蛭科动物菲牛蛭(Poecilobdella manillensis Lesson)。
1.2 实验仪器与试剂
实时荧光定量PCR仪（美国ABI Step one7500）；PCR仪（PTC200，bioRAD）；电泳仪（DYY6C，北京六一仪器厂）；凝胶成像仪（JS380，上海培清科技有限公司）。RNA提取试剂RNAiso Reagent (Takara) ；反转录试剂盒PrimeScriptTMRT regent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)；DNA高保真聚合酶试剂盒PrimeSTAR Max DNA Polymerase（TaKaRa）；DNA 纯化/回收试剂盒MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0（TaKaRa）；克隆载体 pEASYBunt Cloning Vector （TRANS）；大肠杆菌感受态细胞 Trans1T1 Phage Resistant Competent Cell （TRANS）。胶回收试剂盒和八联管为美国 Axygen 公司产品。引物的合成及扩增产物的序列测定均由上海英潍捷基贸易有限公司完成。
2 实验方法
2.1实验设计
于2015年11月将菲牛蛭入土越冬，于2016年6月产卵结束后，将菲牛蛭暂养至玻璃水箱中一个周后，随机分为6组，第一至六组分别用序号Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ代表吸食前和吸食后1、5、15、30、60天六个处理组，每个处理组取3个重复，每个重复10条菲牛蛭，解剖后分别取各个时期的唾液腺、前吸盘、嗉囊、肌肉和直肠，提取菲牛蛭各时期各组织的总RNA，部分材料暂时不提取的放于80℃环境下保存。
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