ph对蚂蟥不同部位消化酶活力的影响
摘要：现阶段蚂蟥的人工养殖虽获得初步成功，但仍未有专属饲料，限制了蚂蟥大规模养殖的发展。本实验运用福林-酚法、对-棕榈酸硝基苯酯(p-NPP)比色法、3，5-二硝基水杨酸比色法测定和比较pH2.2～11.2条件下蚂蟥（Whitmania pigra Whitman）消化道不同部位蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，可为蚂蟥人工饲料研究提供参考。实验结果表明，蛋白在1-5嗉囊，6侧盲囊最适pH值为9.2、7-11侧盲囊和直肠为3.2，；脂肪酶以7-11侧盲囊表现最强，所有部位最适pH均为7.2；淀粉酶主要分布在1-5嗉囊和6侧盲囊，7-11侧盲囊和直肠几乎没有活性，所有部位最适pH均为5.2。
目录
摘要2
关键词2
引言2
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1实验材料和试剂3
1.1.2实验仪器3
1.2方法4
1.2.1酶液的制备4
1.2.2 pH梯度的设定4
1.2.3酶活力的测定4
1.2.4数据4
2结果 5
2.1 pH对蛋白酶活力的影响5
2.2 pH对脂肪酶活力的影响5
2.3 pH对淀粉酶活力的影响5
3 讨论 6
3.1 pH与消化酶活力的关系 6
3.2 消化道酶分布特点以及与食性的关系7
致谢7
参考文献8
Abstract9
引言
表15
图15
图26
pH对蚂蟥不同部位消化酶活力影响的研究
蚂蟥（Whitmania pigra Whitman），又称宽体金线蛭，在分类上隶属于环节动物门（Annelida）蛭纲（Hirudinea）无吻蛭目黄蛭科( Haemopidae)，该种为《中华人民共和国药典》（2010版）药材水蛭的基原动物之一[1]，也是我国水蛭药材市场的主流品种。中药水蛭具有活血化瘀的效果，是治疗心脑血管中成药的主要原料，近几年由于药材水蛭的市场需求激增，同时环境污染日益加剧，导致蚂蟥等基原动物濒临灭绝，供需矛盾突出，人工养殖受到
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
极大关注。
目前由于蚂蟥未有专属人工饵料已限制其大规模养殖，而对蚂蟥消化道生理的研究是其人工饲料研究的基础，但目前国内外对于蚂蟥的研究主要集中在药理药化及呼吸生理的研究[25]，本试验拟研究pH对蚂蟥消化道不同部位蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性的影响，为蚂蟥人工饲料的研究和人工养殖提供理论参考。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1实验材料和试剂：
蚂蟥（由大学中药材研究所提供），经郭巧生教授鉴定为蚂蟥（ Wh. pigra Whitman）。
0.5%淀粉溶液、DNS试剂、 FolinPhenol 试剂（Sigma公司）、0.5%干酪素、考马斯亮蓝G250（南京建成生物技术公司）、0.4molL1的三氯乙酸溶液、磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液、碳酸钠碳酸氢钠缓冲溶液、0.4molL1的碳酸钠溶液、对棕榈酸硝基苯酯pNPP溶液、30%三氯乙酸、10%碳酸钠溶液、0.9%氯化钠溶液、对硝基酚溶液等。
1.1.2实验仪器
756CRT紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、TGL16G离心机（飞鸽）、FA1104分析天平（上海精科天平）、KQ250B超声仪（昆山市超声仪器公司）、DELTA320 型PH计（梅特勒托利多仪器有限公司）、匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。
1.2方法
1.2.1酶液的制备
将活蚂蟥固定于冰盘内解剖取其内脏消化道组织，剔除附着物，用预冷的蒸馏水洗净，用滤纸吸干组织表面水分，准确分离15嗉囊、第6侧盲囊、711侧盲囊和直肠4个部位（见图示），分别称重，冰浴中进行匀浆，同时加蒸馏水，稀释成含原浆20%的溶液，冷冻离心10 min (转速为10000 r／min)，所得上清液为酶液，置于4℃冰箱中低温保存，并在24 h内测定完成。
1：15嗉囊 2：6侧盲囊 3：711侧盲囊 4：直肠
1.2.2 pH梯度的设定
以磷酸氢二钠柠檬酸和碳酸钠—碳酸氢钠为缓冲体系，以1pH为一个梯度，在pH2.2～11.2之间，共设10个pH梯度。各组在37℃条件下测酶的最适pH值。
1.2.3消化酶活力的测定
蛋白酶活性测定采用福林酚法[6]，规定: 在37℃和已定的PH条件下，每分钟水解干酪素产生1μg酪氨酸定义为一个蛋白酶活力单位。
淀粉酶活性测定采用3，5二硝基水杨酸比色法[7]，规定：在37℃的条件下，单位体积的酶量，每分钟水解淀粉生成1mg还原糖的产量为一个淀粉酶活力单位。
脂肪酶活性测定采用对棕榈酸硝基苯酯(pNPP)比色法[8]，规定：在各温度pH条件下，每克组织蛋白在本反应体系中与底物反应1min，释放1μmol 对硝基苯酚为一个酶活力单位。
酶液蛋白含量采用考马斯亮蓝比色法测定。所有样品测定时设3个重复，取平均值。
酶比活力定义：每毫克可溶性酶蛋白所具有的酶活力单位数（U.㎎prot1）。
1.2.4 数据分析
试验数据先用 Microsoft Excel 作初步处理，利用方差分析（ANOVA）检验取样组间数据的差异显著性，显著性水平为α=0.05。
2.结果
2.1 pH对蛋白酶活力的影响
从表1可见，pH对蚂蟥消化道各部分蛋白酶活力有明显的影响，15嗉囊和6侧盲囊的最适pH值为9.2，711侧盲囊和直肠的最适pH值为3.2。15嗉囊和6侧盲囊的蛋白酶活力略大于711侧盲囊和直肠的蛋白酶活力。
表1 pH对蚂蟥蛋白酶活力的影响
Table 1 Effect of pH on the activity of protease of leech
pH
15嗉囊
6侧盲囊
711侧盲囊
直肠
2.2
0.064±0.010d a
0.066±0.010c a
0.144±0.028b a
0.138±0.035b a
目录
摘要2
关键词2
引言2
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1实验材料和试剂3
1.1.2实验仪器3
1.2方法4
1.2.1酶液的制备4
1.2.2 pH梯度的设定4
1.2.3酶活力的测定4
1.2.4数据4
2结果 5
2.1 pH对蛋白酶活力的影响5
2.2 pH对脂肪酶活力的影响5
2.3 pH对淀粉酶活力的影响5
3 讨论 6
3.1 pH与消化酶活力的关系 6
3.2 消化道酶分布特点以及与食性的关系7
致谢7
参考文献8
Abstract9
引言
表15
图15
图26
pH对蚂蟥不同部位消化酶活力影响的研究
蚂蟥（Whitmania pigra Whitman），又称宽体金线蛭，在分类上隶属于环节动物门（Annelida）蛭纲（Hirudinea）无吻蛭目黄蛭科( Haemopidae)，该种为《中华人民共和国药典》（2010版）药材水蛭的基原动物之一[1]，也是我国水蛭药材市场的主流品种。中药水蛭具有活血化瘀的效果，是治疗心脑血管中成药的主要原料，近几年由于药材水蛭的市场需求激增，同时环境污染日益加剧，导致蚂蟥等基原动物濒临灭绝，供需矛盾突出，人工养殖受到
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
极大关注。
目前由于蚂蟥未有专属人工饵料已限制其大规模养殖，而对蚂蟥消化道生理的研究是其人工饲料研究的基础，但目前国内外对于蚂蟥的研究主要集中在药理药化及呼吸生理的研究[25]，本试验拟研究pH对蚂蟥消化道不同部位蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性的影响，为蚂蟥人工饲料的研究和人工养殖提供理论参考。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1实验材料和试剂：
蚂蟥（由大学中药材研究所提供），经郭巧生教授鉴定为蚂蟥（ Wh. pigra Whitman）。
0.5%淀粉溶液、DNS试剂、 FolinPhenol 试剂（Sigma公司）、0.5%干酪素、考马斯亮蓝G250（南京建成生物技术公司）、0.4molL1的三氯乙酸溶液、磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液、碳酸钠碳酸氢钠缓冲溶液、0.4molL1的碳酸钠溶液、对棕榈酸硝基苯酯pNPP溶液、30%三氯乙酸、10%碳酸钠溶液、0.9%氯化钠溶液、对硝基酚溶液等。
1.1.2实验仪器
756CRT紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、TGL16G离心机（飞鸽）、FA1104分析天平（上海精科天平）、KQ250B超声仪（昆山市超声仪器公司）、DELTA320 型PH计（梅特勒托利多仪器有限公司）、匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。
1.2方法
1.2.1酶液的制备
将活蚂蟥固定于冰盘内解剖取其内脏消化道组织，剔除附着物，用预冷的蒸馏水洗净，用滤纸吸干组织表面水分，准确分离15嗉囊、第6侧盲囊、711侧盲囊和直肠4个部位（见图示），分别称重，冰浴中进行匀浆，同时加蒸馏水，稀释成含原浆20%的溶液，冷冻离心10 min (转速为10000 r／min)，所得上清液为酶液，置于4℃冰箱中低温保存，并在24 h内测定完成。
1：15嗉囊 2：6侧盲囊 3：711侧盲囊 4：直肠
1.2.2 pH梯度的设定
以磷酸氢二钠柠檬酸和碳酸钠—碳酸氢钠为缓冲体系，以1pH为一个梯度，在pH2.2～11.2之间，共设10个pH梯度。各组在37℃条件下测酶的最适pH值。
1.2.3消化酶活力的测定
蛋白酶活性测定采用福林酚法[6]，规定: 在37℃和已定的PH条件下，每分钟水解干酪素产生1μg酪氨酸定义为一个蛋白酶活力单位。
淀粉酶活性测定采用3，5二硝基水杨酸比色法[7]，规定：在37℃的条件下，单位体积的酶量，每分钟水解淀粉生成1mg还原糖的产量为一个淀粉酶活力单位。
脂肪酶活性测定采用对棕榈酸硝基苯酯(pNPP)比色法[8]，规定：在各温度pH条件下，每克组织蛋白在本反应体系中与底物反应1min，释放1μmol 对硝基苯酚为一个酶活力单位。
酶液蛋白含量采用考马斯亮蓝比色法测定。所有样品测定时设3个重复，取平均值。
酶比活力定义：每毫克可溶性酶蛋白所具有的酶活力单位数（U.㎎prot1）。
1.2.4 数据分析
试验数据先用 Microsoft Excel 作初步处理，利用方差分析（ANOVA）检验取样组间数据的差异显著性，显著性水平为α=0.05。
2.结果
2.1 pH对蛋白酶活力的影响
从表1可见，pH对蚂蟥消化道各部分蛋白酶活力有明显的影响，15嗉囊和6侧盲囊的最适pH值为9.2，711侧盲囊和直肠的最适pH值为3.2。15嗉囊和6侧盲囊的蛋白酶活力略大于711侧盲囊和直肠的蛋白酶活力。
表1 pH对蚂蟥蛋白酶活力的影响
Table 1 Effect of pH on the activity of protease of leech
pH
15嗉囊
6侧盲囊
711侧盲囊
直肠
2.2
0.064±0.010d a
0.066±0.010c a
0.144±0.028b a
0.138±0.035b a
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/zyx/526.html
