its条形码序列的石斛属植物的基原鉴定研究(附件)
摘 要石斛类药材的药用开发和利用较为广泛且历史悠久。在药典中记录着具备有益胃生津，清热滋阴的功效，常被用于热病伤津，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热，目暗不明，筋骨痿软等。是非常常用的重要中药材，并且具有较高的经济价值。由于石斛资源在开发研究中需求量较大，经济效益高，时常会有伪品次品混入，严重影响人们用药的安全性及有效性。所以对石斛属植物，物种身份鉴定的准确性显得就尤为重要。然而传统鉴定方法在实际应用中具有一定局限性，因此本实验基于ITS序列对14份从云南收集来的石斛材料进行DNA条形码鉴定，共收集14份石斛材料，实验获取未知石斛叶片ITS序列以及结合GenBank下载序列共14个物种77条序列。并使用CodonCode Aligner V6.0.2拼接剪辑，利用MEGA 6.0软件进行变异位点分析，遗传距离计算和构建邻接(NJ)系统发育聚类树，对石斛材料进行基原鉴定及聚类关系分析，并评价其鉴定效果。
目 录
1 绪论 5
1.1 研究背景与立题依据 5
1.2石斛属植物流通现状 5
1.3 DNA条形码鉴定原理 6
1.4DNA条形码研究现状 6
2 研究内容 9
2.1 研究目的 9
2.2实验内容 9
2.3实验材料的收集与处理 9
2.4实验仪器与试剂 10
2.4.1仪器 10
2.4.2试剂 10
2.5实验步骤 10
2.5.1 DNA分子的提取 10
2.5.2 PCR扩增 11
2.5.3 PCR产物检测 11
2.5.4 产物测序 12
2.5.5 DNA序列分析 12
3 结果与分析 13
3.1 PCR扩增效率 13
3.2 ITS序列分析 13
结 论 17
参考文献 19
致 谢 21
1 绪论
1.1 研究背景与立题依据
石斛属(Dendrobium Sw.)约1000种，广泛分布于亚洲热带和 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
亚热带地区至大洋洲[3]。我国有74种和2个变种，产自秦岭往南的多个省市地区，特别是以云南南部较多[1]。是兰科(Orchidaceae)最大的属之一含有40多种重要的药用植物，是中国的传统名贵中药材，2010版《中国药典》中收载石斛的来源为：金钗石斛( D. nobile Lindl. )、鼓槌石斛( D. chrysotoxum Lindl)或流苏石斛(D.fimbriatum Hook.)的栽培品及其同属植物近似种的新鲜或干燥茎 [1]。由于石斛资源在开发研究中需求量较大，经济效益高，时常会有伪品次品混入，严重影响人们用药的安全性及有效性。所以对石斛属植物的物种身份鉴定的准确性就显得尤为重要。传统鉴定方式有：基原、性状、显微、理化鉴定等，此类方法存在的主观性和经验依赖性较强，很容易就会受被鉴定对象的环境、个体的生长和鉴定学者的个人原因等影响鉴定结果，然而DNA条形码技术与传统的物种鉴定方法相比而言，就具有精准性更高、效率更高、并且不容易被其他原因困扰等优越处[4]。近年来在石斛属植物鉴定中使用最多的就是DNA条形码技术，并且已有许多的学者对一些种类的石斛属植物进行了判定、系统进化分析以及DNA条形码的探究[2]。因此本实验基于ITS序列对从云南收集来的14份未知石斛属植物材料进行基原鉴定以及分析评价。
1.2石斛属植物流通现状
石斛属植物的药用研发和使用都是在世界的前沿的，就像铁皮石斛，就是一种非常名贵的中药材，另外还有一部分石斛属植物，例如春石斛，具有很大的观赏价值，这两种石斛属植物都具备极高的经济价值，不论是药用还是观赏，都越来越受消费者的追捧，那么由此而来的经济效益也是可观的，就会开始有人研发外形相似的伪品次品进入市场流通，例如，药材市场上存在大批不同替代品混用，名字相同药物不同，因短缺而供应紧张的药材用亲缘关系近的药物，甚至利用其他伪品冒充金贵药物的情况[8]。对于石斛属植物了解不全面的消费者来说就很容易被骗，买到药用价值低的，甚至没有药用价值的药材，这都严 重影响到用药的安全性和有效性。并且近些年由于石斛属植物可观的市场需求，不停的有来自其他国家的石斛属植物进入我国的市场，目前这些缘由都造成了石斛属植物通行中难以克服的石斛属药材鱼龙混杂现象[9]，因此研究出有效地石斛属植物的鉴定方法是非常有必要的，从各个方面入手，利用各种方式方法，越全面越好，弥补每一种方法不足的地方。例如本实验使用的DNA条形码鉴定方法就可以在传统鉴别法紧靠肉眼无法区分真伪时更加精准的鉴别出真伪。在我们国家，中药材基本都在规模大的药材买卖场所里面流通，就算是去掉中药材出现的个人参假等因素后[10]，流通时的中药材也会由于品种、产处、加工、配送、存储等许多原因的不一样，使质量出现很大区别[11]，这类差距致使了墟市的不平衡及不正当竞争，同时还形成了中药资源的挥霍。但是DNA条形码技术就可以在管理和鉴别的环节很大一定程度上的减少这一类问题[9]。
1.3 DNA条形码鉴定原理
DNA条形码是在2003年的时候由加拿大的动物学家赫伯特最先让人们知道的[10]，它的原理是使用基因组中的一段大家都认为比较短的DNA序列，进而来完成动物、植物判定的，一种分子生物学鉴定方式技巧，是其他鉴别方法的很有效的一种增补方法。因为DNA序列是由A、G、C、T四种碱基以不同的顺序来排列构成的，因此一定长度的DNA序列就足够可以被用来划分区别不同的物种。中药材DNA条形码鉴定，是以ITS2序列为主体条形码序列来鉴定中药材的方式体系，然后以psbAtrnH序列为辅助序列，对需要检测的中药材进行鉴定[12]。
1.4DNA条形码研究现状
由于传统鉴定方法主要取决于学者的知识面和主官判定，会有很大程度的局限性[13]，所以许多学者开始了更为全面的研究药材的鉴定方法，本实验所利用到的DNA条形码技术就被认定为是传统鉴定方法的有效增补，该技术现在已经基本成熟，通过筛选然后确定条形码，再进行创立条形码库和鉴定平台，经过生物信息学分析要领来剖析、对照DNA条形码，以此对物种完成鉴定[14]。最近这些年以来，使用基因组中比较规格的短DNA片段从而进行物种鉴定的DNA条形码方式，已经成为了生物物种的分类、以及物种的鉴定过程中钻研的热门和新的目标。开始被更多人熟知并获得了很多的认可。的确DNA条形码鉴定技术拥有更高的准确性，效率也更高，影响因素更少等优点，用于植物鉴定中的频率越来越高。最近这些年来DNA的序列标记方式中，比如核糖体rDNA ITS序列、叶绿体psbAtrnH序列还有matK序列等等，已经被普遍使用在石斛类鉴定里，这些方法中的ITS序列在石斛属植物种间的分辨率相对而言更高一些[15]，因此ITS序列成为了石斛属植物DNA鉴别中效率最高的序列标记方法。但是，当前ITS序列被用于石斛属植物的研究里面，主体是集中在冰冻材料、新鲜材料或者是硅胶干燥后的材料上面，关于ITS序列被用于药材干品的鉴别还很少听闻。石斛属植物材料的干燥、储存等方面都可能导致DNA不一样层次的降解，因此在从干燥药材中获得高质量的DNA是分子鉴定的关键部分。
目 录
1 绪论 5
1.1 研究背景与立题依据 5
1.2石斛属植物流通现状 5
1.3 DNA条形码鉴定原理 6
1.4DNA条形码研究现状 6
2 研究内容 9
2.1 研究目的 9
2.2实验内容 9
2.3实验材料的收集与处理 9
2.4实验仪器与试剂 10
2.4.1仪器 10
2.4.2试剂 10
2.5实验步骤 10
2.5.1 DNA分子的提取 10
2.5.2 PCR扩增 11
2.5.3 PCR产物检测 11
2.5.4 产物测序 12
2.5.5 DNA序列分析 12
3 结果与分析 13
3.1 PCR扩增效率 13
3.2 ITS序列分析 13
结 论 17
参考文献 19
致 谢 21
1 绪论
1.1 研究背景与立题依据
石斛属(Dendrobium Sw.)约1000种，广泛分布于亚洲热带和 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
亚热带地区至大洋洲[3]。我国有74种和2个变种，产自秦岭往南的多个省市地区，特别是以云南南部较多[1]。是兰科(Orchidaceae)最大的属之一含有40多种重要的药用植物，是中国的传统名贵中药材，2010版《中国药典》中收载石斛的来源为：金钗石斛( D. nobile Lindl. )、鼓槌石斛( D. chrysotoxum Lindl)或流苏石斛(D.fimbriatum Hook.)的栽培品及其同属植物近似种的新鲜或干燥茎 [1]。由于石斛资源在开发研究中需求量较大，经济效益高，时常会有伪品次品混入，严重影响人们用药的安全性及有效性。所以对石斛属植物的物种身份鉴定的准确性就显得尤为重要。传统鉴定方式有：基原、性状、显微、理化鉴定等，此类方法存在的主观性和经验依赖性较强，很容易就会受被鉴定对象的环境、个体的生长和鉴定学者的个人原因等影响鉴定结果，然而DNA条形码技术与传统的物种鉴定方法相比而言，就具有精准性更高、效率更高、并且不容易被其他原因困扰等优越处[4]。近年来在石斛属植物鉴定中使用最多的就是DNA条形码技术，并且已有许多的学者对一些种类的石斛属植物进行了判定、系统进化分析以及DNA条形码的探究[2]。因此本实验基于ITS序列对从云南收集来的14份未知石斛属植物材料进行基原鉴定以及分析评价。
1.2石斛属植物流通现状
石斛属植物的药用研发和使用都是在世界的前沿的，就像铁皮石斛，就是一种非常名贵的中药材，另外还有一部分石斛属植物，例如春石斛，具有很大的观赏价值，这两种石斛属植物都具备极高的经济价值，不论是药用还是观赏，都越来越受消费者的追捧，那么由此而来的经济效益也是可观的，就会开始有人研发外形相似的伪品次品进入市场流通，例如，药材市场上存在大批不同替代品混用，名字相同药物不同，因短缺而供应紧张的药材用亲缘关系近的药物，甚至利用其他伪品冒充金贵药物的情况[8]。对于石斛属植物了解不全面的消费者来说就很容易被骗，买到药用价值低的，甚至没有药用价值的药材，这都严 重影响到用药的安全性和有效性。并且近些年由于石斛属植物可观的市场需求，不停的有来自其他国家的石斛属植物进入我国的市场，目前这些缘由都造成了石斛属植物通行中难以克服的石斛属药材鱼龙混杂现象[9]，因此研究出有效地石斛属植物的鉴定方法是非常有必要的，从各个方面入手，利用各种方式方法，越全面越好，弥补每一种方法不足的地方。例如本实验使用的DNA条形码鉴定方法就可以在传统鉴别法紧靠肉眼无法区分真伪时更加精准的鉴别出真伪。在我们国家，中药材基本都在规模大的药材买卖场所里面流通，就算是去掉中药材出现的个人参假等因素后[10]，流通时的中药材也会由于品种、产处、加工、配送、存储等许多原因的不一样，使质量出现很大区别[11]，这类差距致使了墟市的不平衡及不正当竞争，同时还形成了中药资源的挥霍。但是DNA条形码技术就可以在管理和鉴别的环节很大一定程度上的减少这一类问题[9]。
1.3 DNA条形码鉴定原理
DNA条形码是在2003年的时候由加拿大的动物学家赫伯特最先让人们知道的[10]，它的原理是使用基因组中的一段大家都认为比较短的DNA序列，进而来完成动物、植物判定的，一种分子生物学鉴定方式技巧，是其他鉴别方法的很有效的一种增补方法。因为DNA序列是由A、G、C、T四种碱基以不同的顺序来排列构成的，因此一定长度的DNA序列就足够可以被用来划分区别不同的物种。中药材DNA条形码鉴定，是以ITS2序列为主体条形码序列来鉴定中药材的方式体系，然后以psbAtrnH序列为辅助序列，对需要检测的中药材进行鉴定[12]。
1.4DNA条形码研究现状
由于传统鉴定方法主要取决于学者的知识面和主官判定，会有很大程度的局限性[13]，所以许多学者开始了更为全面的研究药材的鉴定方法，本实验所利用到的DNA条形码技术就被认定为是传统鉴定方法的有效增补，该技术现在已经基本成熟，通过筛选然后确定条形码，再进行创立条形码库和鉴定平台，经过生物信息学分析要领来剖析、对照DNA条形码，以此对物种完成鉴定[14]。最近这些年以来，使用基因组中比较规格的短DNA片段从而进行物种鉴定的DNA条形码方式，已经成为了生物物种的分类、以及物种的鉴定过程中钻研的热门和新的目标。开始被更多人熟知并获得了很多的认可。的确DNA条形码鉴定技术拥有更高的准确性，效率也更高，影响因素更少等优点，用于植物鉴定中的频率越来越高。最近这些年来DNA的序列标记方式中，比如核糖体rDNA ITS序列、叶绿体psbAtrnH序列还有matK序列等等，已经被普遍使用在石斛类鉴定里，这些方法中的ITS序列在石斛属植物种间的分辨率相对而言更高一些[15]，因此ITS序列成为了石斛属植物DNA鉴别中效率最高的序列标记方法。但是，当前ITS序列被用于石斛属植物的研究里面，主体是集中在冰冻材料、新鲜材料或者是硅胶干燥后的材料上面，关于ITS序列被用于药材干品的鉴别还很少听闻。石斛属植物材料的干燥、储存等方面都可能导致DNA不一样层次的降解，因此在从干燥药材中获得高质量的DNA是分子鉴定的关键部分。
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