响应面法优化活血丹三萜酸类提取工艺的研究

目录
摘要1
关键词1
引言1
1材料1
1.1 试验材料1
1.2 仪器与试剂1
2方法与结果1
2.1 色谱条件1
2.2 溶液的制备2
2.2.1标准品溶液的制备2
2.2.2供试品溶液的制备2
2.3 单因素实验2
2.3.1提取溶剂2
2.3.2超声时间2
2.3.3液料比2
2.4 响应面实验3
2.4.1响应面设计3
2.4.2响应曲面和等高线图分析5
2.4.3验证试验7
3讨论8
3.1 实验因素选择8
3.2 不同提取方法比较8
致谢8
参考文献9
Abstract10
Key words10
响应面法优化活血丹三萜酸类提取工艺的研究
学 生 文静熊
［摘要］ 目的：优选活血丹中三萜酸类的提取工艺。方法：在查阅文献资料和单因素实验的基础上，以乙醇浓度、液料比、超声时间为自变量，活血丹三萜酸类的提取率为响应值，依据BoxBehnken原理设计三因素三水平实验。结果：通过回归分析得到最优提取工艺参数为：乙醇浓度88%、液料比78 mLg1、超声时间60 min。齐墩果酸和熊果酸的含量预测值分别为0.8547 mgg1和1.8471 mgg1，实际值分别为0.8504 mgg1和1.7367 mgg1，相对误差分别为1.29%与5.98%。结论：方程与真实试验情况拟合较好，通过响应面优选的活血丹提取工艺合理可行，可为该药材的质量控制提供实验依据。
［关键词］ 活血丹；齐墩果酸；熊果酸；超声；响应面
活血丹Glechoma longituba (Nakai) Kupr.为唇形科活血丹属多年草本植物，其干燥地上部分入药，药材名连钱草（《中华人民共和国药典》（2015年版）收录），具有清热解毒、利尿通淋、散瘀消肿的功能[1]。我国活血丹资源丰富，是全国各地民间广泛应用的药用植物，临床上主要应用于黄疸型肝炎、
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胆石症、肾结石、疮痈肿痛、腮腺炎、胆囊炎、膀胱结石、多发性脓疡、疟疾等症的治疗[2]。其主要成分为黄酮及其苷类，挥发油，有机酸，萜类，生物碱和其他类等，其中齐墩果酸和熊果酸是活血丹中主要所含的五环三萜类化合物，具有抗肿瘤、保肝、抗炎、降糖等作用[35]。
目前国内外对活血丹的研究主要集中在化学成分、药材品质、药理作用和繁殖方法等方面[611]，有关运用响应面法优化活血丹三萜酸类提取工艺的研究尚未报道。近年来，有学者对连钱草中总黄酮和三萜酸类成分（主要为熊果酸和齐墩果酸）的含量测定方法进行了研究，并用此来控制该药材的质量[1213]。为保证活血丹中三萜酸类含量测定方法的准确性和稳定性，首要条件是选择适合的提取工艺。据此，本研究以活血丹为实验材料，利用响应面分析法[14]就其三萜酸类成分提取工艺的优化进行探究，以期为活血丹质量综合评价体系的完善提供参考。
1 材料
1.1 试验材料
本试验所用试验材料（生长良好且无病害）于2015年5月采于江苏省南京市紫金山南坡山脚下，经大学郭巧生教授鉴定为唇形科活血丹属植物活血丹Glechoma longituba (Nakai)Kupr.。采收后去除杂质、洗净、晒干，粉碎后过60目筛，于阴凉干燥处存放，备用。
1.2 仪器与试剂
仪器：BSM220.4型电子天平（上海卓精电子科技有限公司）；PS60A型超声波清洗器（深圳洁康超声波清洗机有限公司）；安捷伦1100型液相色谱仪（包括四元泵系统，在线脱气系统，自动进样器，柱温箱和VWD检测器；数据采集与处理采用安捷伦化学工作站）。
试剂：乙酸胺（分析纯，天津市华东试剂厂）；95%乙醇（分析纯，广东光华科技股份有限公司）；乙腈，甲醇（色谱纯，美国OMNICHEM公司）。齐墩果酸（批号110709200304），熊果酸（批号110742201421，含量以93.8%计）对照品均购自中国食品药品检定研究院。水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 以乙腈（A） 0.05%乙酸铵（B）为流动相进行等度洗脱，洗脱比例（A : B）为77:23，色谱柱为迪马钻石plus C18，4.6×250 mm，5 μm；检测波长为210 nm；流速为0.5 mLmin1；进样量为10 μL。
2.2 溶液的制备
2.2.1 标准品溶液的制备 精密称取齐墩果酸对照品14.1 mg和熊果酸对照品11.2 mg，用甲醇溶解，定容至25 mL，4 ℃ 贮藏，配成浓度分别为0.564 mgmL1和0.420 mgmL1的标准品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取活血丹粉末（过60目筛）0.5 g，加入88%乙醇39 mL，称定重量，超声提取（超声频率：40 KHz；超声电功率：150 W）60 min，取出静置至室温，称定补足重量，过0.45 μm微孔滤膜，即得。
2.3 单因素实验
2.3.1 提取溶剂 目前，齐墩果酸与熊果酸的提取多采用醇提法[1517]，故选择常用的甲醇和乙醇进行试验，比较二者的提取效果。具体提取方法如下：精密称取活血丹药材粉末0.5 g 6份，置于50 mL锥形瓶中，随机分为两组，每组3份，一组加入无水乙醇50 mL，另一组加入纯甲醇50 mL，称定重量后，超声提取1 h，放冷后用溶剂补足重量，0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。按2.1项下色谱条件进样检测，结果见表1。
表1 不同提取溶剂比较
Table 1 Comparison of different extraction solvents
溶剂名称
齐墩果酸mgg1
熊果酸mgg1
乙醇
0.4723±0.0090
1.6883±0.0308
甲醇
0.4015±0.0062
1.7095±0.0334
对齐墩果酸而言，乙醇的提取效果优于甲醇；甲醇对熊果酸的提取效果略优于乙醇，但不同提取溶剂对熊果酸的影响相对较小（表1）。因此，综合考虑二者的提取效果及操作安全性，选择乙醇为较佳的提取溶剂。另外，齐墩果酸与熊果酸皆为五环三萜类化合物，二者互为同分异构体，性质较为相似，均易溶于乙醇、甲醇、乙醚、丙酮、氯仿等有机溶剂，不溶于水[18]，因此，根据相似相溶的原理，极性较大的溶剂不适用于齐墩果酸和熊果酸的提取，故选择一定范围内较高浓度的乙醇进行试验。

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