蚂蟥冬眠过程中临界温度的研究
摘要：研究不同温度下（25℃、20℃、15℃、10℃、8℃、6℃、4℃、2℃）蚂蟥的活动状态以及耗氧量和耗氧率的变化。同时研究不同温度下（25℃、10℃、8℃、6℃、4℃、2℃）蚂蟥消化道消化酶的变化，从而确定蚂蟥冬眠过程中的临界温度。结果表明：（1）蚂蟥在4℃呈现“弯月”状，不食不动伏于瓶底。（2）蚂蟥冬眠过程中耗氧量和耗氧率与温度的关联呈单边下降型。在25℃到8℃之间极显著下降（P＜0.01），在8℃到4℃之间显著下降（P＜0.05），在4℃到2℃之间无显著下降（P＞0.05）。（3）蚂蟥冬眠过程中三种消化酶与温度的关联都呈单边下降型。除酸性蛋白酶在6℃到2℃之间无显著下降（P＞0.05），其余都在4℃到2℃之间无显著下降（P＞0.05）。综合以上结果认为：蚂蟥冬眠过程中的临界温度为4℃～6℃，在此温度范围内蚂蟥进入冬眠。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料与仪器 2
1.1.1 实验材料2
1.1.2 实验仪器2
1.2 实验方法 2
1.2.1 实验设计2
1.2.2 酶液的制备2
1.2.3 淀粉酶活力测定2
1.2.4 脂肪酶活力测定2
1.2.5 蛋白酶活力测定3
1.3 数据分析 3
2 结果与分析3
2.1 蚂蟥冬眠过程中活动状态的观察3
2.2 蚂蟥冬眠过程中耗氧量及耗氧率测定3
2.3 蚂蟥冬眠过程中消化道消化酶活力测定3
2.3.1 蚂蟥冬眠过程中消化道淀粉酶活力测定3
2.3.2 蚂蟥冬眠过程中消化道脂肪酶活力测定4
2.3.3 蚂蟥冬眠过程中消化道蛋白酶活力测定4
3 讨论5
3.1 蚂蟥冬眠过程中活动状态与温度的关系5
3.2 蚂蟥冬眠过程中耗氧量及耗氧率与温度的关系5
3.3 蚂蟥冬眠过程中消化道消化酶与温度的关系5
4 小结与展望6
致谢6
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
参考文献6
蚂蟥冬眠过程中临界温度的研究
引言
蚂蟥（Whitmania pigra Whitman）是中药材水蛭的基原动物之一，也是治疗心脑血管疾病的原料药[1]。但是由于生存环境的污染，市场需求的增加，野生蚂蟥的数量急剧减少等原因，蚂蟥原药材及其制品的价格不断攀升。因此蚂蟥的人工养殖技术逐渐受到重视[2]。虽然蚂蟥的人工养殖已取得初步成功，但蚂蟥“冬眠”的习性极大的影响了其生产效益。
蚂蟥是变温动物，其摄食习性、生长发育都与水温密切相关。王安纲等对宽体金线蛭的生物学特性的研究表明：蚂蟥的最适生长温度在20℃～28℃之间[3]。同时高明等对宽体金线蛭的生长和温度关系的研究表明：随着水温继续升高到30℃时，蚂蟥的生长显著下降（P＜0.05），并且开始有部分蚂蟥死亡[4]。“冬眠”是蚂蟥生长的重要阶段，然而近年来对于蚂蟥的研究大多侧重在药理和生理方面，例如：刘飞等对蚂蟥和水蛭种间遗传变异和系统关系的ITS序列的研究[5]，刘喜华等对金边蚂蟥抗痛风作用的研究[6]等，但是蚂蟥人工养殖方面的研究却很少。
本研究通过观察蚂蟥冬眠过程中的活动状态，测定蚂蟥冬眠过程中耗氧量和耗氧率以及消化道消化酶活力，确定了蚂蟥冬眠过程中的临界温度，为以后研究蚂蟥冬眠的机理，也为其人工养殖方面的研究工作奠定了基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料与仪器
1．1．1 实验材料
由大学中药研究所提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥（Whitmania pigra Whitman），实验前进行12h停食静放处理；水为充分曝气24 h以上的自来水。
1．1．2 实验仪器
Alpha1506紫外可见分光光度计（上海谱光仪器有限公司）、MR210A溶氧测量仪（南京特安科贸有限公司）、FYLYS108L低温保存箱（北京福意电器有限公司）、HHS型水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）、FA1104分析天平（上海精密科学仪器有限公司）、匀浆机、离心机、呼吸仪（自制）。
1．2 实验方法
1．2．1 实验设计
本实验设有8个温度梯度（25℃、20℃、15℃、10℃、8℃、6℃、4℃、2℃），每个梯度有10个重复，每个重复1条蚂蟥。从同批孵化、同条件养殖的蚂蟥中，挑选相近体重（10.24±1.61ｇ）的蚂蝗随机分配到各试验组中，观察活动状态并进行耗氧量测定实验。利用电子天平记录蚂蟥的体重，利用溶氧测量仪测定蚂蟥的耗氧量，然后计算出耗氧率。
1．2．2 酶液的制备
本实验设有6个温度梯度（25℃、10℃、8℃、6℃、4℃、2℃），每个梯度有3个重复，每个重复1条蚂蟥。把同批孵化、同条件养殖的蚂蟥随机分配到各试验组中，进行不同温度的处理。把处理后的蚂蟥放在冰浴中进行解剖，得到全部消化道分别称重记录。添加准备好的生理盐水，用匀浆机在冰水浴中匀浆[7]。将匀浆后的液体以4000 r/min进行离心15 min，用组织匀浆上清液进行消化酶活力测定实验。
1．2．3 淀粉酶活力测定
采取DNS试剂比色法进行测定[8]。将上一步制备的粗酶液滴加在各试管中，再分别加入相应pH值的缓冲液，混匀。把各试管放在37℃水浴锅中加热7min（使酶恢复活力），并将对照试管放在100℃沸水中煮7min（使酶失去活力）。再向两组试管中加入准备好的的淀粉溶液并混匀，在37℃水浴锅中反应18min后再加入DNS试剂并混匀。立即沸水失活，冷却稀释，测光吸收值。把37℃下水解淀粉1mg/min成为还原糖称为一个酶活力单位。
1．2．4 脂肪酶活力测定
采取对棕榈酸硝基苯酯（pNPP）比色法进行测定[9]。取配好的pNPP底物，37℃加热3min后加入酶液，在8min后加入TCA，混合均匀，放置5min终止反应，再加入NaOH调pH值，直至pH值与反应前一致（用去离子水替换酶液，其他条件不变，即得空白），测光吸收值。
1．2．5 蛋白酶活力测定
采取福林酚试剂法[10]。在试管中放入酪蛋白溶液，添加已定pH值的缓冲溶液，摇匀，在37℃水浴锅中加热5min。在反应管中加入准备好的粗酶液，控制水浴锅的反应温度15min，立即加入TCA终止反应，静静放置15min。在对照试管中加入TCA后再加酶液，过滤，取滤液加Na2CO3和福林酚试剂，摇匀。在30℃水浴中显色15min。测光吸收值。把37℃下水解酪蛋白1μg/min产生酪氨酸称为一个酶活力单位。
1．3 数据分析
实验数据通过Microsoft Excel和SPSS Statistics 17.0统计软件进行分析，描述性统计值使用平均值±标准差（x±SD）表示，显著水平为0.05，极显著水平为0.01。
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引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料与仪器 2
1.1.1 实验材料2
1.1.2 实验仪器2
1.2 实验方法 2
1.2.1 实验设计2
1.2.2 酶液的制备2
1.2.3 淀粉酶活力测定2
1.2.4 脂肪酶活力测定2
1.2.5 蛋白酶活力测定3
1.3 数据分析 3
2 结果与分析3
2.1 蚂蟥冬眠过程中活动状态的观察3
2.2 蚂蟥冬眠过程中耗氧量及耗氧率测定3
2.3 蚂蟥冬眠过程中消化道消化酶活力测定3
2.3.1 蚂蟥冬眠过程中消化道淀粉酶活力测定3
2.3.2 蚂蟥冬眠过程中消化道脂肪酶活力测定4
2.3.3 蚂蟥冬眠过程中消化道蛋白酶活力测定4
3 讨论5
3.1 蚂蟥冬眠过程中活动状态与温度的关系5
3.2 蚂蟥冬眠过程中耗氧量及耗氧率与温度的关系5
3.3 蚂蟥冬眠过程中消化道消化酶与温度的关系5
4 小结与展望6
致谢6
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
参考文献6
蚂蟥冬眠过程中临界温度的研究
引言
蚂蟥（Whitmania pigra Whitman）是中药材水蛭的基原动物之一，也是治疗心脑血管疾病的原料药[1]。但是由于生存环境的污染，市场需求的增加，野生蚂蟥的数量急剧减少等原因，蚂蟥原药材及其制品的价格不断攀升。因此蚂蟥的人工养殖技术逐渐受到重视[2]。虽然蚂蟥的人工养殖已取得初步成功，但蚂蟥“冬眠”的习性极大的影响了其生产效益。
蚂蟥是变温动物，其摄食习性、生长发育都与水温密切相关。王安纲等对宽体金线蛭的生物学特性的研究表明：蚂蟥的最适生长温度在20℃～28℃之间[3]。同时高明等对宽体金线蛭的生长和温度关系的研究表明：随着水温继续升高到30℃时，蚂蟥的生长显著下降（P＜0.05），并且开始有部分蚂蟥死亡[4]。“冬眠”是蚂蟥生长的重要阶段，然而近年来对于蚂蟥的研究大多侧重在药理和生理方面，例如：刘飞等对蚂蟥和水蛭种间遗传变异和系统关系的ITS序列的研究[5]，刘喜华等对金边蚂蟥抗痛风作用的研究[6]等，但是蚂蟥人工养殖方面的研究却很少。
本研究通过观察蚂蟥冬眠过程中的活动状态，测定蚂蟥冬眠过程中耗氧量和耗氧率以及消化道消化酶活力，确定了蚂蟥冬眠过程中的临界温度，为以后研究蚂蟥冬眠的机理，也为其人工养殖方面的研究工作奠定了基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料与仪器
1．1．1 实验材料
由大学中药研究所提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥（Whitmania pigra Whitman），实验前进行12h停食静放处理；水为充分曝气24 h以上的自来水。
1．1．2 实验仪器
Alpha1506紫外可见分光光度计（上海谱光仪器有限公司）、MR210A溶氧测量仪（南京特安科贸有限公司）、FYLYS108L低温保存箱（北京福意电器有限公司）、HHS型水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）、FA1104分析天平（上海精密科学仪器有限公司）、匀浆机、离心机、呼吸仪（自制）。
1．2 实验方法
1．2．1 实验设计
本实验设有8个温度梯度（25℃、20℃、15℃、10℃、8℃、6℃、4℃、2℃），每个梯度有10个重复，每个重复1条蚂蟥。从同批孵化、同条件养殖的蚂蟥中，挑选相近体重（10.24±1.61ｇ）的蚂蝗随机分配到各试验组中，观察活动状态并进行耗氧量测定实验。利用电子天平记录蚂蟥的体重，利用溶氧测量仪测定蚂蟥的耗氧量，然后计算出耗氧率。
1．2．2 酶液的制备
本实验设有6个温度梯度（25℃、10℃、8℃、6℃、4℃、2℃），每个梯度有3个重复，每个重复1条蚂蟥。把同批孵化、同条件养殖的蚂蟥随机分配到各试验组中，进行不同温度的处理。把处理后的蚂蟥放在冰浴中进行解剖，得到全部消化道分别称重记录。添加准备好的生理盐水，用匀浆机在冰水浴中匀浆[7]。将匀浆后的液体以4000 r/min进行离心15 min，用组织匀浆上清液进行消化酶活力测定实验。
1．2．3 淀粉酶活力测定
采取DNS试剂比色法进行测定[8]。将上一步制备的粗酶液滴加在各试管中，再分别加入相应pH值的缓冲液，混匀。把各试管放在37℃水浴锅中加热7min（使酶恢复活力），并将对照试管放在100℃沸水中煮7min（使酶失去活力）。再向两组试管中加入准备好的的淀粉溶液并混匀，在37℃水浴锅中反应18min后再加入DNS试剂并混匀。立即沸水失活，冷却稀释，测光吸收值。把37℃下水解淀粉1mg/min成为还原糖称为一个酶活力单位。
1．2．4 脂肪酶活力测定
采取对棕榈酸硝基苯酯（pNPP）比色法进行测定[9]。取配好的pNPP底物，37℃加热3min后加入酶液，在8min后加入TCA，混合均匀，放置5min终止反应，再加入NaOH调pH值，直至pH值与反应前一致（用去离子水替换酶液，其他条件不变，即得空白），测光吸收值。
1．2．5 蛋白酶活力测定
采取福林酚试剂法[10]。在试管中放入酪蛋白溶液，添加已定pH值的缓冲溶液，摇匀，在37℃水浴锅中加热5min。在反应管中加入准备好的粗酶液，控制水浴锅的反应温度15min，立即加入TCA终止反应，静静放置15min。在对照试管中加入TCA后再加酶液，过滤，取滤液加Na2CO3和福林酚试剂，摇匀。在30℃水浴中显色15min。测光吸收值。把37℃下水解酪蛋白1μg/min产生酪氨酸称为一个酶活力单位。
1．3 数据分析
实验数据通过Microsoft Excel和SPSS Statistics 17.0统计软件进行分析，描述性统计值使用平均值±标准差（x±SD）表示，显著水平为0.05，极显著水平为0.01。
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