枸杞多肽的制备及其活性研究
目 录
第一章 文献综述 1
1.1 课题简介 1
1.2 生物活性肽的制备与分离 1
1.3 生物活性肽的研究进展 2
1.3.1 抗氧化肽 2
1.3.2 免疫活性肽 2
1.3.3 抗菌肽 2
1.3.4 酶调节及抑制肽 3
1.3.5 神经活性肽 3
1.3.6 促进矿物质吸收肽 3
1.4 本课题研究的内容 3
第二章 枸杞多肽的制备 5
2.1 主要原料、设备和试剂 5
2.1.1 主要原料及材料 5
2.1.2 主要设备 5
2.1.3 主要药品 6
2.2 实验方法 7
2.2.1 枸杞粗蛋白的提取 7
2.2.2 枸杞蛋白的酶解工艺 8
2.2.3 枸杞多肽的分离纯化 9
2.3 结果分析 10
2.3.1 枸杞蛋白粗提物的制备 10
2.3.2 响应面优化酶解工艺 10
2.3.3 多肽制备结果分析 15
第三章 枸杞多肽A-1活性研究 18
3.1 主要原料、设备和试剂 18
3.1.1 主要原料及设备 18
3.1.2 主要药品 18
3.2 实验方法 19
3.2.1 枸杞多肽（A-1）抗氧化活性研究 19
3.2.2 枸杞多肽（A-1）乳化性和乳化稳定性的研究 19
3.2.3 枸杞多肽（A-1）起泡性和泡沫稳定性的研究 20
3. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
3 结果分析 20
3.3.1 枸杞多肽（A-1）抗氧化活性结果分析 20
3.3.2 枸杞多肽（A-1）乳化性和乳化稳定性的研究 22
3.3.3 枸杞多肽（A-1）起泡性和泡沫稳定性的研究 23
结 论 25
致 谢 27
参 考 文 献 28第一章 文献综述
1.1 课题简介
宁夏枸杞(Lycium barbarum)在我国西、北方地区分布广泛，耐干旱和低温，对土壤酸碱度要求低，具有补肝肾、增强免疫系统功能、抑制脂肪在肝细胞沉淀聚集、促进肝细胞再生的作用[1]。枸杞中的蛋白质因其不含胆固醇，所以具有一定的抗氧化和降低血糖的作用，比一般的动物性食物更利于食用和药用[2]。目前枸杞作为一种养生保健食品深受大家的喜爱。近年来，对枸杞子的药理研究、药用活性成分和综合利用等方面研究较多，对于宁夏枸杞或枸杞营养成分的分析研究主要在枸杞多糖、维生素、甜菜碱及黄酮类，而枸杞蛋白的研究多集中于稳定性方面，对于其中的营养成分研究甚少。已知宁夏枸杞全果粗蛋白含量10.6%左右，含有18种氨基酸，其中8种为必需氨基酸[3]。枸杞多肽作为其中有生物活性的成分，具有较高的食用价值。
本课题采用优质价廉的枸杞为原料提取食用粗蛋白和枸杞多肽，将其中的蛋白质资源利用成分。不仅解决枸杞深加工中大量副产品的出路问题，提高了产品的附加值，还缓解了我方优质蛋白和功能肽的需求问题，增加农民的收入的同时避免了资源的浪费。进一步研究枸杞多肽的制备方法，研究出具有营养保健功能的食品成分，利于提高枸杞的转化率和利用率，也为综合利用枸杞资源提供了有效的途径。
多肽是α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，人体摄入的蛋白质经过酶的水解，主要是以肽的形式被消化和吸收[4]。生物活性肽是由两个或以上的氨基酸通过肽键连接的化合物[5]，是涉及生物体内多种细胞功能的生物活性物质, 参与机体完成各种复杂的生理活动 [6]，其生理活性取决于分子量的大小、氨基酸的种类及排列分布顺序。
1.2 生物活性肽的制备与分离
研究制备生物活性肽的途径很多，主要包括以下三种[7]：①直接提取动植物体内天然存在的肽类；②蛋白质降解提取；③化学合成法和基因重组法提取活性肽。自然界中天然的活性肽含量较少，不宜大批量的提取；合成法提取的成本高及过程中会产生有害的副产物限制了其提取工艺；蛋白质水解法包括酶解法和化学水解法，应用较为普遍，常作为活性肽制备的首要选择[8]，酶解法具有成本低、水解过程容易控制、无有害副产物的生成等优势[9]。
对植物蛋白酶解产物的分离纯化，可以获得更高效、专一的活性肽。活性肽分离纯化的方法因原料、水解工艺和待分离产物的理化性质的差异而有所不同。目前多肽的分离纯化方法，包括高效液相色谱法、离子交换色谱法、超滤法、毛细管等电聚焦电泳、逆流分布、疏水交互作用色谱和其他分离纯化方法联用法等方法，而高效液相色谱法最为常用且最重要。
张志斐等[10]人用传统方法提取枸杞多肽，获得微红色的多肽粗提物，应用MALDI-TOF-MS分析得出枸杞子多肽主要由5种成分组成，相对分子质量分别为2810.37、3211.45、3563.72、3682.96、4230.84Da。
1.3 生 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
物活性肽的研究进展
各个国家提取多肽所用的原料不同，获取肽的方法不同，产品的性质也有所不同。上个世纪五六十年代，许多国家从动物脏器中提取肽。在美国硅谷就有一家用固相与液相合成法混合提取肽。酸、碱解法生产的大豆多肽主要作为食品添加剂加入到老人和儿童的食品中，目的是增强他们对食品营养的吸收和利用。近年来，生物活性肽普遍用酶法生产，主要在中国，将人们平常食用的食物中的蛋白质用食品级的植物蛋白酶酶解成小分子的活性肽。
1.3.1 抗氧化肽
抗氧化肽作为生物活性肽，具有清除自由基、保护生物膜、解毒排毒等功能。蒋万志等[11]人采用D-半乳糖衰老小鼠模型[12]，以抗氧化剂（维生素 E）进行对照，观察小鼠行为学及学习记忆等方面，得出应用枸杞多肽能够明显增加D-半乳糖致衰老小鼠的体重，提高模型小鼠学习记忆能力。同时，进行各项检测发现，治疗组的小鼠脑组织超氧化物歧化酶(SOD)活性显著增强，且对丙二醛含量明显降低，总结出枸杞多肽能增强机体的抗氧化，延缓衰老。
1.3.2 免疫活性肽
免疫活性肽是一类由免疫细胞产生能通过直接或间接作用，调节细胞功能、促进机体特异性及非特异性免疫功能的活性肽。张志斐等[13]人采用HPLC色谱系统（SPHerisorC18色谱柱＋乙腈溶液），在214nm下对枸杞多肽的各组分采取分封收集及纯度分析，并用MTT比色法测定抑制率，证实PFL-1在体外对HT29细胞生长有抑制作用，为一种天然抗瘤物。
2. 选择出最适的蛋白酶，采用响应面实验研究提取工艺参数(提取温度、加酶比、提取时间、PH)对枸杞多肽DPPH清除率的影响，确定出最适酶解条件；
3. 采用离子交换层析、凝胶过滤层析对枸杞多肽进行分离纯化，纯化出活性较高的组分，便于进一步分析其活性；
2.1 主要原料、设备和试剂
2.1.1 主要原料及材料
名称 生产厂家
（2）0.2mol/L的NaH2PO4：称取NaH2PO42H2O?3.12 g加重蒸水至100mL溶解；
第一章 文献综述 1
1.1 课题简介 1
1.2 生物活性肽的制备与分离 1
1.3 生物活性肽的研究进展 2
1.3.1 抗氧化肽 2
1.3.2 免疫活性肽 2
1.3.3 抗菌肽 2
1.3.4 酶调节及抑制肽 3
1.3.5 神经活性肽 3
1.3.6 促进矿物质吸收肽 3
1.4 本课题研究的内容 3
第二章 枸杞多肽的制备 5
2.1 主要原料、设备和试剂 5
2.1.1 主要原料及材料 5
2.1.2 主要设备 5
2.1.3 主要药品 6
2.2 实验方法 7
2.2.1 枸杞粗蛋白的提取 7
2.2.2 枸杞蛋白的酶解工艺 8
2.2.3 枸杞多肽的分离纯化 9
2.3 结果分析 10
2.3.1 枸杞蛋白粗提物的制备 10
2.3.2 响应面优化酶解工艺 10
2.3.3 多肽制备结果分析 15
第三章 枸杞多肽A-1活性研究 18
3.1 主要原料、设备和试剂 18
3.1.1 主要原料及设备 18
3.1.2 主要药品 18
3.2 实验方法 19
3.2.1 枸杞多肽（A-1）抗氧化活性研究 19
3.2.2 枸杞多肽（A-1）乳化性和乳化稳定性的研究 19
3.2.3 枸杞多肽（A-1）起泡性和泡沫稳定性的研究 20
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3 结果分析 20
3.3.1 枸杞多肽（A-1）抗氧化活性结果分析 20
3.3.2 枸杞多肽（A-1）乳化性和乳化稳定性的研究 22
3.3.3 枸杞多肽（A-1）起泡性和泡沫稳定性的研究 23
结 论 25
致 谢 27
参 考 文 献 28第一章 文献综述
1.1 课题简介
宁夏枸杞(Lycium barbarum)在我国西、北方地区分布广泛，耐干旱和低温，对土壤酸碱度要求低，具有补肝肾、增强免疫系统功能、抑制脂肪在肝细胞沉淀聚集、促进肝细胞再生的作用[1]。枸杞中的蛋白质因其不含胆固醇，所以具有一定的抗氧化和降低血糖的作用，比一般的动物性食物更利于食用和药用[2]。目前枸杞作为一种养生保健食品深受大家的喜爱。近年来，对枸杞子的药理研究、药用活性成分和综合利用等方面研究较多，对于宁夏枸杞或枸杞营养成分的分析研究主要在枸杞多糖、维生素、甜菜碱及黄酮类，而枸杞蛋白的研究多集中于稳定性方面，对于其中的营养成分研究甚少。已知宁夏枸杞全果粗蛋白含量10.6%左右，含有18种氨基酸，其中8种为必需氨基酸[3]。枸杞多肽作为其中有生物活性的成分，具有较高的食用价值。
本课题采用优质价廉的枸杞为原料提取食用粗蛋白和枸杞多肽，将其中的蛋白质资源利用成分。不仅解决枸杞深加工中大量副产品的出路问题，提高了产品的附加值，还缓解了我方优质蛋白和功能肽的需求问题，增加农民的收入的同时避免了资源的浪费。进一步研究枸杞多肽的制备方法，研究出具有营养保健功能的食品成分，利于提高枸杞的转化率和利用率，也为综合利用枸杞资源提供了有效的途径。
多肽是α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，人体摄入的蛋白质经过酶的水解，主要是以肽的形式被消化和吸收[4]。生物活性肽是由两个或以上的氨基酸通过肽键连接的化合物[5]，是涉及生物体内多种细胞功能的生物活性物质, 参与机体完成各种复杂的生理活动 [6]，其生理活性取决于分子量的大小、氨基酸的种类及排列分布顺序。
1.2 生物活性肽的制备与分离
研究制备生物活性肽的途径很多，主要包括以下三种[7]：①直接提取动植物体内天然存在的肽类；②蛋白质降解提取；③化学合成法和基因重组法提取活性肽。自然界中天然的活性肽含量较少，不宜大批量的提取；合成法提取的成本高及过程中会产生有害的副产物限制了其提取工艺；蛋白质水解法包括酶解法和化学水解法，应用较为普遍，常作为活性肽制备的首要选择[8]，酶解法具有成本低、水解过程容易控制、无有害副产物的生成等优势[9]。
对植物蛋白酶解产物的分离纯化，可以获得更高效、专一的活性肽。活性肽分离纯化的方法因原料、水解工艺和待分离产物的理化性质的差异而有所不同。目前多肽的分离纯化方法，包括高效液相色谱法、离子交换色谱法、超滤法、毛细管等电聚焦电泳、逆流分布、疏水交互作用色谱和其他分离纯化方法联用法等方法，而高效液相色谱法最为常用且最重要。
张志斐等[10]人用传统方法提取枸杞多肽，获得微红色的多肽粗提物，应用MALDI-TOF-MS分析得出枸杞子多肽主要由5种成分组成，相对分子质量分别为2810.37、3211.45、3563.72、3682.96、4230.84Da。
1.3 生 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
物活性肽的研究进展
各个国家提取多肽所用的原料不同，获取肽的方法不同，产品的性质也有所不同。上个世纪五六十年代，许多国家从动物脏器中提取肽。在美国硅谷就有一家用固相与液相合成法混合提取肽。酸、碱解法生产的大豆多肽主要作为食品添加剂加入到老人和儿童的食品中，目的是增强他们对食品营养的吸收和利用。近年来，生物活性肽普遍用酶法生产，主要在中国，将人们平常食用的食物中的蛋白质用食品级的植物蛋白酶酶解成小分子的活性肽。
1.3.1 抗氧化肽
抗氧化肽作为生物活性肽，具有清除自由基、保护生物膜、解毒排毒等功能。蒋万志等[11]人采用D-半乳糖衰老小鼠模型[12]，以抗氧化剂（维生素 E）进行对照，观察小鼠行为学及学习记忆等方面，得出应用枸杞多肽能够明显增加D-半乳糖致衰老小鼠的体重，提高模型小鼠学习记忆能力。同时，进行各项检测发现，治疗组的小鼠脑组织超氧化物歧化酶(SOD)活性显著增强，且对丙二醛含量明显降低，总结出枸杞多肽能增强机体的抗氧化，延缓衰老。
1.3.2 免疫活性肽
免疫活性肽是一类由免疫细胞产生能通过直接或间接作用，调节细胞功能、促进机体特异性及非特异性免疫功能的活性肽。张志斐等[13]人采用HPLC色谱系统（SPHerisorC18色谱柱＋乙腈溶液），在214nm下对枸杞多肽的各组分采取分封收集及纯度分析，并用MTT比色法测定抑制率，证实PFL-1在体外对HT29细胞生长有抑制作用，为一种天然抗瘤物。
2. 选择出最适的蛋白酶，采用响应面实验研究提取工艺参数(提取温度、加酶比、提取时间、PH)对枸杞多肽DPPH清除率的影响，确定出最适酶解条件；
3. 采用离子交换层析、凝胶过滤层析对枸杞多肽进行分离纯化，纯化出活性较高的组分，便于进一步分析其活性；
2.1 主要原料、设备和试剂
2.1.1 主要原料及材料
名称 生产厂家
（2）0.2mol/L的NaH2PO4：称取NaH2PO42H2O?3.12 g加重蒸水至100mL溶解；
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