源于streptomycessp.cc5碱性蛋白酶基因的克隆及其在枯草芽孢杆菌中的表达
：目前碱性蛋白酶广泛应用于洗涤剂、制革、丝绸等工业上，具有不可替代的作用。该酶来源于细菌、放线菌和真菌，其中研究最广泛且最深入的是芽孢杆菌的丝氨酸蛋白酶。本文从链霉菌CC5中克隆出碱性丝氨酸蛋白酶编码基因，并将其与pMD19-T Vector酶连，经测序正确后，通过酶切和酶连与枯草芽孢杆菌质粒pMA09进行重组表达载体的构建，并将其转化到枯草芽孢杆菌WB800中，挑取阳性转化子进行PCR验证，最终获得了整合有碱性丝氨酸蛋白酶基因的重组枯草芽孢杆菌。
目录
摘要 4
关键词 4
Abstract 4
Key Words 4
绪论 4
1 材料 5
1.1 菌株及质粒 5
1.2 培养基 5
1.3 主要试剂与溶液 5
2 方法 6
2.1 碱性丝氨酸蛋白酶基因afeE的扩增及纯化 6
2.1.1 引物设计 6
2.1.2 目的基因PCR扩增及产物纯化 6
2.2 碱性丝氨酸蛋白酶基因afeE的TA克隆 7
2.2.1 PCR产物与pMD19T Vector的连接 7
2.2.2 大肠杆菌感受态制备 7
2.2.3 酶连产物转化大肠杆菌感受态细胞 8
2.2.4 阳性转化子菌液PCR鉴定及序列测定 8
2.2.5 重组质粒pMD19TafeE的提取(试剂盒） 8
2.3 表达载体的构建 9
2.3.1 重组质粒pMD19TafeE与pMA09载体双酶切 9
2.3.2 碱性丝氨酸蛋白酶基因与pMA09载体的酶连........................................................10
2.3.3 表达载体转化大肠杆菌扩增 ....10
2.3.4 阳性菌落的鉴定 10
2.4 重组质粒pMA09afeE的转化 11
2.4.1 重组质粒pMA09afeE的提取与纯化 11
2.4.2 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备 11
2.4.3 枯
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草芽孢杆菌的转化 11
2.4.4 转化子鉴定 11
2.5 转化子碱性丝氨酸蛋白酶酶活测定 12
3 结果与分析 12
3.1 碱性丝氨酸蛋白酶基因的扩增 12
3.2 克隆载体的构建及验证 13
3.3 表达载体的构建及验证 14
3.4 重组枯草芽孢杆菌的构建及表达 15
3.4.1 转化子鉴定 15
3.4.2 碱性丝氨酸蛋白酶酶活测定 16
4 讨论 16
致谢 17
参考文献...................................................................................................................................17
附录...........................................................................................................................................18
源于Streptomyces sp. CC5碱性蛋白酶基因的克隆及其在枯草芽孢杆菌中的表达
目录
摘要 4
关键词 4
Abstract 4
Key Words 4
绪论 4
1 材料 5
1.1 菌株及质粒 5
1.2 培养基 5
1.3 主要试剂与溶液 5
2 方法 6
2.1 碱性丝氨酸蛋白酶基因afeE的扩增及纯化 6
2.1.1 引物设计 6
2.1.2 目的基因PCR扩增及产物纯化 6
2.2 碱性丝氨酸蛋白酶基因afeE的TA克隆 7
2.2.1 PCR产物与pMD19T Vector的连接 7
2.2.2 大肠杆菌感受态制备 7
2.2.3 酶连产物转化大肠杆菌感受态细胞 8
2.2.4 阳性转化子菌液PCR鉴定及序列测定 8
2.2.5 重组质粒pMD19TafeE的提取(试剂盒） 8
2.3 表达载体的构建 9
2.3.1 重组质粒pMD19TafeE与pMA09载体双酶切 9
2.3.2 碱性丝氨酸蛋白酶基因与pMA09载体的酶连........................................................10
2.3.3 表达载体转化大肠杆菌扩增 ....10
2.3.4 阳性菌落的鉴定 10
2.4 重组质粒pMA09afeE的转化 11
2.4.1 重组质粒pMA09afeE的提取与纯化 11
2.4.2 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备 11
2.4.3 枯
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草芽孢杆菌的转化 11
2.4.4 转化子鉴定 11
2.5 转化子碱性丝氨酸蛋白酶酶活测定 12
3 结果与分析 12
3.1 碱性丝氨酸蛋白酶基因的扩增 12
3.2 克隆载体的构建及验证 13
3.3 表达载体的构建及验证 14
3.4 重组枯草芽孢杆菌的构建及表达 15
3.4.1 转化子鉴定 15
3.4.2 碱性丝氨酸蛋白酶酶活测定 16
4 讨论 16
致谢 17
参考文献...................................................................................................................................17
附录...........................................................................................................................................18
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