小鼠肝脏早期发育的基因调控
小鼠肝脏早期发育的基因调控[20200614172109]
摘要: 肝脏作为一个重要的内脏器官，在体内发挥着多种功能，例如：代谢功能、解毒作用以及胆汁分泌等等。肝脏发育是一个非常复杂的过程，受到许多信号的精确调控。对肝脏发育过程中不同时期基因的表达情况进行研究有利于解析肝脏发育过程的相关机制，并且指导体外高效诱导多能性干细胞向成熟肝细胞的分化。本课题利用荧光激活细胞分拣术（fluorescence-activated cell sorting, FACS）从小鼠胚胎中分离出前肠内胚层细胞以及新生成肝细胞，并通过RNA-seq对这两个时期的细胞进行了转录组分析。此项研究将帮助我们更好地理解在发育早期内胚层前体细胞向肝脏分化的调控机制。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
关键字:肝脏早期发育；FACS；RNA-seq；基因调控
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 4
1.1主要仪器及设备 4
1.2 主要试剂及其制备 5
1.3 小鼠饲养及超数排卵 5
1.4 E8.25及E9.5胎鼠相应组织的取材 5
1.4.1 剥离胚胎 5
1.4.2 切取相应组织 6
1.4.3 组织消化 6
1.5 FACS 分选阳性细胞 6
1.6 RNA-seq文库构建 7
1.6.1 细胞总RNA提取 7
1.6.2 总RNA的质量评估 7
1.6.3 转录组测序文库构建 7
2 结果与分析 9
2.1 FACS分选细胞 9
2.1.1 FACS分选E8.25小鼠胚胎ENDM1+内胚层细胞 9
2.1.2 FACS分选E9.5小鼠胚胎Dlk+成肝细胞 10
2.2 样品总RNA质检结果 10
2.2.1 样品总RNA纯度及浓度检测结果 10
2.2.2 样品总RNA完整性检测结果 10
3 讨论 11
3.1 反思总结 11
3.2 工作展望 12
致谢 12
参考文献： 12
小鼠肝脏早期发育的基因调控
国家生命科学与技术人才培养基地班学生 冯烨
引言
肝脏是人体内最大的内脏器官，在体内发挥着重要的作用，例如：药物解毒、能量代谢、蛋白质合成以及胆汁分泌等。肝小叶是肝结构和 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
功能的基本单位，呈多面棱柱状。肝小叶主要由肝细胞组成，这些细胞以小叶中央的静脉为中心，向四周略呈放射状排列，形成肝细胞板。
在我国，大约有10%的人群患有肝脏疾病，例如肝纤维化，肝硬化，肝炎，以及肝癌等等，其中每年约有30万人被各类肝病引起的肝硬化或肝癌夺去生命，因此我国正面临着肝脏疾病的巨大挑战。虽然肝脏有一定的再生能力，但再生的过程非常缓慢。目前对于严重的肝脏疾病，原位肝移植仍是最有效的治疗策略，但肝源缺乏、费用昂贵、移植排斥反应及长期应用免疫抑制剂引起并发症等成为限制其广泛应用的主要原因[1]。有研究发现，胚胎干细胞来源的肝细胞移植能部分恢复肝脏功能[2, 3]，但此方法依然存在着许多问题，例如：体外分化过程不稳定、诱导分化得到的肝样细胞产率及纯度不高[4]以及肝样细胞分化不成熟，保留胚肝细胞（fatal hepatocytes）性质[2, 3, 5]。由此可见，要想从胚胎干细胞分化得到成熟的肝细胞，需要对每一步分化过程精确调控，并严格筛选合适的细胞以便进入下一步分化过程。想要完成这一挑战，就必须深入了解体内发育过程中每一个阶段的特征，尤其是基因表达水平，表观遗传印记以及触发这些调控网络的信号通路。如果能很好的揭示这些，就能在很大程度上推动胚胎干细胞向肝细胞的体外分化。
肝脏的发育是一个复杂的过程，主要可以分为两个阶段：首先前肠内胚层感受心脏中胚层的信号而建立“响应态(competence)”，肝向特化基因逐渐表达并形成新生肝芽，其次是肝脏内细胞群体如肝细胞和胆管细胞的分化成熟阶段。发育过程的主要事件如图1所示：内胚层在原肠形成时期从外胚层分离出来并逐步发育成前肠、中肠和后肠三个部位。小鼠肝脏起源于E8左右的腹前肠内胚层[6]，并在E8.5完成肝脏命运决定；E8.5至E9.0，肝上皮细胞开始表达肝脏标志基因并逐步发育成肝憩室；E9.0至E10，肝母细胞转移至横隔间充质（septum transversum mesenchyme,STM）而形成新生肝芽；肝芽逐渐发育成肝脏，在E15时，成肝细胞分化为肝细胞和胆管上皮细胞；之后进入肝脏的成熟阶段，这个阶段从胚胎时期延伸至产后[7]。
图1 小鼠肝脏发育过程[7]
肝脏的发育过程受到多种外部和内部信号分子的诱导。在体内，肝脏与胰腺具有一个早期的共同起源，及腹前肠内胚层的双潜能前体细胞[8]。心脏中胚层分泌的成纤维生长因子（fibroblast growth factor, FGF）及STM分泌的骨成型蛋白质（bone morphogenetic protein, BMPs）是成肝的关键信号[9-11]。不同浓度的FGF将会导致前体细胞向不同器官分化：从高到低的FGF浓度分别诱导肺、肝脏和胰腺的分化[8, 12]，也就是说，当FGF被抑制时，腹前肠内胚层细胞会终止肝脏分化命运而起始胰腺分化命运。最近的研究表明，β-转化生长因子(transforming growth factor-β, TGF-β)也参与了肝脏的命运决定，而它的作用与BMP相反，即抑制肝脏分化命运，诱导胰腺分化命运[13]。作者还指出，由于因子间存在相互抑制的情况，在体外诱导特定细胞分化时，提供积极的促进因子与抑制相关的阻遏信号同样重要。由此可见，肝脏命运的起始收到众多信号的调控，关键信号的改变将改变肝脏的命运走向。
在肝脏命运决定不久（E8.5-E9.0） *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
，腹前肠内胚层上皮细胞开始表达肝脏标志基因(Albumin, Afp, Hnf4α)，并从简单的立方形变成假复层柱状上皮，形成肝憩室[14]。E9.0至E9.5，肝脏内胚层周围的基质降解使得肝脏内胚层细胞，也称作成肝细胞向STM转移并形成新生肝芽[14]。许多转录因子以及来源于内皮细胞的信号参与了这个过程：造血细胞表达的同源异形框因子(hematopoietically expressed homeobox, Hhex)调控肝细胞命运的腹侧内胚层的增殖和定位[15]，而且该因子对于成肝细胞的转移也是必要的[14]。缺失Hhex的小鼠胚胎虽然可以进行肝脏的特化(hepatic specification)，但是不能完成肝芽的形态建成（liver bud morphogenesis），并且会缺少胆囊和胰腺[16]。另一方面，有研究显示GATA结合蛋白4(GATA binding protein 4, Gata4)和GATA结合蛋白6(GATA binding protein 6,Gata6)可通过反式激活Hhex启动子从而对肝细胞的发育起着更直接的作用[17, 18]。此外，还有研究表明其他的一些转录调控子也能促进成肝细胞的迁移，如图2所示，这些因子包括一些同源异形框因子Prox1、Onecut-1以及Onecut-2，这些因子的作用时间稍晚于Hhex和Gata。总之，许多研究显示转录因子网络的构建对腹内胚层向肝脏发生以及随后肝芽的形态建成非常重要，并且这些过程是相当复杂的[7]。
图2 肝芽形态建成
E9.5至E15，肝芽经历了快速的生长并成为胚胎时期主要的造血组织。这个生长过程受到肝间质分泌的旁信号以及成肝细胞自身基因的共同调控。许多相关基因的突变会导致E10至E16的胚胎死亡，这主要是由于成肝细胞增殖受阻以及细胞死亡而引发的严重贫血[7]。
虽然已有的工作对于肝脏发生与发育中的基因调控网络有了一定的研究，但结果大多数基于传统的研究方法，只是对少数转录因子的调控研究。如果想了解清楚整个肝脏发生和早期发育过程中有哪些基因参与以及相互调控关系，就必须在转录组层面上展开研究。根据对肝脏发生与早期发育的了解，我们认为E8.25左右是肝脏命运决定的起始时期，E9.5是肝芽的形成时期，之间的过程是肝脏命运决定的关键时期，对于解析肝脏早期发育具有重要意义。因此，我们选取E8.25及E9.5作为本课题研究的时间点，结合RNA-seq及相关的数据分析手段对两个时期的细胞（E8.25腹前肠内胚层细胞及E9.5成肝细胞）进行转录组分析。
摘要: 肝脏作为一个重要的内脏器官，在体内发挥着多种功能，例如：代谢功能、解毒作用以及胆汁分泌等等。肝脏发育是一个非常复杂的过程，受到许多信号的精确调控。对肝脏发育过程中不同时期基因的表达情况进行研究有利于解析肝脏发育过程的相关机制，并且指导体外高效诱导多能性干细胞向成熟肝细胞的分化。本课题利用荧光激活细胞分拣术（fluorescence-activated cell sorting, FACS）从小鼠胚胎中分离出前肠内胚层细胞以及新生成肝细胞，并通过RNA-seq对这两个时期的细胞进行了转录组分析。此项研究将帮助我们更好地理解在发育早期内胚层前体细胞向肝脏分化的调控机制。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
关键字:肝脏早期发育；FACS；RNA-seq；基因调控
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 4
1.1主要仪器及设备 4
1.2 主要试剂及其制备 5
1.3 小鼠饲养及超数排卵 5
1.4 E8.25及E9.5胎鼠相应组织的取材 5
1.4.1 剥离胚胎 5
1.4.2 切取相应组织 6
1.4.3 组织消化 6
1.5 FACS 分选阳性细胞 6
1.6 RNA-seq文库构建 7
1.6.1 细胞总RNA提取 7
1.6.2 总RNA的质量评估 7
1.6.3 转录组测序文库构建 7
2 结果与分析 9
2.1 FACS分选细胞 9
2.1.1 FACS分选E8.25小鼠胚胎ENDM1+内胚层细胞 9
2.1.2 FACS分选E9.5小鼠胚胎Dlk+成肝细胞 10
2.2 样品总RNA质检结果 10
2.2.1 样品总RNA纯度及浓度检测结果 10
2.2.2 样品总RNA完整性检测结果 10
3 讨论 11
3.1 反思总结 11
3.2 工作展望 12
致谢 12
参考文献： 12
小鼠肝脏早期发育的基因调控
国家生命科学与技术人才培养基地班学生 冯烨
引言
肝脏是人体内最大的内脏器官，在体内发挥着重要的作用，例如：药物解毒、能量代谢、蛋白质合成以及胆汁分泌等。肝小叶是肝结构和 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
功能的基本单位，呈多面棱柱状。肝小叶主要由肝细胞组成，这些细胞以小叶中央的静脉为中心，向四周略呈放射状排列，形成肝细胞板。
在我国，大约有10%的人群患有肝脏疾病，例如肝纤维化，肝硬化，肝炎，以及肝癌等等，其中每年约有30万人被各类肝病引起的肝硬化或肝癌夺去生命，因此我国正面临着肝脏疾病的巨大挑战。虽然肝脏有一定的再生能力，但再生的过程非常缓慢。目前对于严重的肝脏疾病，原位肝移植仍是最有效的治疗策略，但肝源缺乏、费用昂贵、移植排斥反应及长期应用免疫抑制剂引起并发症等成为限制其广泛应用的主要原因[1]。有研究发现，胚胎干细胞来源的肝细胞移植能部分恢复肝脏功能[2, 3]，但此方法依然存在着许多问题，例如：体外分化过程不稳定、诱导分化得到的肝样细胞产率及纯度不高[4]以及肝样细胞分化不成熟，保留胚肝细胞（fatal hepatocytes）性质[2, 3, 5]。由此可见，要想从胚胎干细胞分化得到成熟的肝细胞，需要对每一步分化过程精确调控，并严格筛选合适的细胞以便进入下一步分化过程。想要完成这一挑战，就必须深入了解体内发育过程中每一个阶段的特征，尤其是基因表达水平，表观遗传印记以及触发这些调控网络的信号通路。如果能很好的揭示这些，就能在很大程度上推动胚胎干细胞向肝细胞的体外分化。
肝脏的发育是一个复杂的过程，主要可以分为两个阶段：首先前肠内胚层感受心脏中胚层的信号而建立“响应态(competence)”，肝向特化基因逐渐表达并形成新生肝芽，其次是肝脏内细胞群体如肝细胞和胆管细胞的分化成熟阶段。发育过程的主要事件如图1所示：内胚层在原肠形成时期从外胚层分离出来并逐步发育成前肠、中肠和后肠三个部位。小鼠肝脏起源于E8左右的腹前肠内胚层[6]，并在E8.5完成肝脏命运决定；E8.5至E9.0，肝上皮细胞开始表达肝脏标志基因并逐步发育成肝憩室；E9.0至E10，肝母细胞转移至横隔间充质（septum transversum mesenchyme,STM）而形成新生肝芽；肝芽逐渐发育成肝脏，在E15时，成肝细胞分化为肝细胞和胆管上皮细胞；之后进入肝脏的成熟阶段，这个阶段从胚胎时期延伸至产后[7]。
图1 小鼠肝脏发育过程[7]
肝脏的发育过程受到多种外部和内部信号分子的诱导。在体内，肝脏与胰腺具有一个早期的共同起源，及腹前肠内胚层的双潜能前体细胞[8]。心脏中胚层分泌的成纤维生长因子（fibroblast growth factor, FGF）及STM分泌的骨成型蛋白质（bone morphogenetic protein, BMPs）是成肝的关键信号[9-11]。不同浓度的FGF将会导致前体细胞向不同器官分化：从高到低的FGF浓度分别诱导肺、肝脏和胰腺的分化[8, 12]，也就是说，当FGF被抑制时，腹前肠内胚层细胞会终止肝脏分化命运而起始胰腺分化命运。最近的研究表明，β-转化生长因子(transforming growth factor-β, TGF-β)也参与了肝脏的命运决定，而它的作用与BMP相反，即抑制肝脏分化命运，诱导胰腺分化命运[13]。作者还指出，由于因子间存在相互抑制的情况，在体外诱导特定细胞分化时，提供积极的促进因子与抑制相关的阻遏信号同样重要。由此可见，肝脏命运的起始收到众多信号的调控，关键信号的改变将改变肝脏的命运走向。
在肝脏命运决定不久（E8.5-E9.0） *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
，腹前肠内胚层上皮细胞开始表达肝脏标志基因(Albumin, Afp, Hnf4α)，并从简单的立方形变成假复层柱状上皮，形成肝憩室[14]。E9.0至E9.5，肝脏内胚层周围的基质降解使得肝脏内胚层细胞，也称作成肝细胞向STM转移并形成新生肝芽[14]。许多转录因子以及来源于内皮细胞的信号参与了这个过程：造血细胞表达的同源异形框因子(hematopoietically expressed homeobox, Hhex)调控肝细胞命运的腹侧内胚层的增殖和定位[15]，而且该因子对于成肝细胞的转移也是必要的[14]。缺失Hhex的小鼠胚胎虽然可以进行肝脏的特化(hepatic specification)，但是不能完成肝芽的形态建成（liver bud morphogenesis），并且会缺少胆囊和胰腺[16]。另一方面，有研究显示GATA结合蛋白4(GATA binding protein 4, Gata4)和GATA结合蛋白6(GATA binding protein 6,Gata6)可通过反式激活Hhex启动子从而对肝细胞的发育起着更直接的作用[17, 18]。此外，还有研究表明其他的一些转录调控子也能促进成肝细胞的迁移，如图2所示，这些因子包括一些同源异形框因子Prox1、Onecut-1以及Onecut-2，这些因子的作用时间稍晚于Hhex和Gata。总之，许多研究显示转录因子网络的构建对腹内胚层向肝脏发生以及随后肝芽的形态建成非常重要，并且这些过程是相当复杂的[7]。
图2 肝芽形态建成
E9.5至E15，肝芽经历了快速的生长并成为胚胎时期主要的造血组织。这个生长过程受到肝间质分泌的旁信号以及成肝细胞自身基因的共同调控。许多相关基因的突变会导致E10至E16的胚胎死亡，这主要是由于成肝细胞增殖受阻以及细胞死亡而引发的严重贫血[7]。
虽然已有的工作对于肝脏发生与发育中的基因调控网络有了一定的研究，但结果大多数基于传统的研究方法，只是对少数转录因子的调控研究。如果想了解清楚整个肝脏发生和早期发育过程中有哪些基因参与以及相互调控关系，就必须在转录组层面上展开研究。根据对肝脏发生与早期发育的了解，我们认为E8.25左右是肝脏命运决定的起始时期，E9.5是肝芽的形成时期，之间的过程是肝脏命运决定的关键时期，对于解析肝脏早期发育具有重要意义。因此，我们选取E8.25及E9.5作为本课题研究的时间点，结合RNA-seq及相关的数据分析手段对两个时期的细胞（E8.25腹前肠内胚层细胞及E9.5成肝细胞）进行转录组分析。
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