no对cu2+胁迫下的灵芝生长代谢的影响
：在高等生物中，硝酸还原酶（NR）和亚硝酸还原酶（NiR）对初级氮的同化起主要作用，同时是胞内一氧化氮的产生的主要途径之一。本实验利用铜离子胁迫灵芝菌丝生长，通过检测野生型菌株以及NR和NiR基因沉默菌株的一氧化氮含量、生长速度、三萜含量等指标，建立一氧化氮含量变化与其它灵芝各项生理生化指标的改变之间的联系。本实验推测，在铜离子胁迫下一氧化氮信号参与了影响灵芝生长并初步构建铜离子、一氧化氮、灵芝次生代谢之间的关系模型。为进一步阐明铜离子胁迫下一氧化氮的信号变化影响灵芝各生物合成的分子机制提供材料。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key words 2
引言 2
1 材料与方法 3
1．1 材料 3
1．1．1 供试菌株 3
1．1．2 CYM培养基的配置 3
1．1．3 主要试剂与溶液 3
1．1．4 主要仪器设备 3
1．2 方法 3
1．2．1 菌种平板活化 3
1．2．2 液体种子摇瓶培养 3
1．2．3 不同浓度Cu2+CYM培养基的配制 3
1．2．4 二次摇瓶发酵培养 3
1．2．5 灵芝菌丝生长情况测定 4
1．2．6 灵芝三萜含量的测定 4
1．2．7 胞内NO含量检测 4
2 结果与分析 4
2．1 Cu2+胁迫对野生型灵芝三萜含量、菌丝生长速度的影响 4
2．2 Cu2+胁迫下野生型菌株胞内NO含量变化 5
2．3 Cu2+胁迫下NR和NiR基因沉默型灵芝菌株平板生长以及生长速度变化 5
2．4 NO含量在Cu2+胁迫下NR和NiR基因沉默型灵芝菌丝中的变化 6
2．4．1 DCF2DA荧光探针检测胞内NO含量 6
2．4．2 NO定量试剂盒检测胞内NO含量 7
2．5 Cu2+胁迫下NR和NiR基因沉默型菌株灵芝三萜合成情况 8
3 讨论 9
致谢：
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
9
参考文献： 10
NO对Cu2+胁迫下的灵芝生长代谢的影响
引言
引言
近年来，国内外学者对灵芝的化学、药理及临床效果等方面进行了研究，目前已从灵芝中分离得到160多种化合物，其中三萜类化合物具有显著的生理活性，是灵芝的主要药用成分[1,2]。大量的实验证明灵芝三萜类化合物具有抗肿瘤、降血压、降血脂、抗过敏和保肝等功能[3,4]。
自1982年Kubota.T首次从赤灵芝中分离得到三萜类化合物以来，国内外研究者对灵芝中三萜类化合物的提取、分离和结构鉴定进行了很多研究，先后从灵芝子实体及孢子中分离出100多种三萜类化合物，其结构均为高度氧化的羊毛甾烷衍生物。因三萜类化合物是灵芝发挥治疗作用的关键，灵芝中三萜类物质含量的多少决定了灵芝药效的高低。故在目前灵芝中三萜含量还较低的情况下，提高灵芝三萜含量，成为进一步提高灵芝的药用价值的重要问题。
作为在1992年被Science杂志评定的“年度分子”，一氧化氮（nitric oxide，NO）已成为当今胞内信号转导的热点之一。有实验证明NO可以广泛参与动物体内众多的生理、病理过程， 在生殖系统、神经系统、免疫系统等各个系统中都具有重要作用[5]。在真菌中，关于NO的研究发现，真菌细胞可以主动地通过生物合成途径生成NO，这种有目的性的NO合成表明了NO在真菌中发挥着重要的生物学作用。NO可以激活环鸟苷酸的合成，而环鸟苷酸是一种重要的第二信使分子参与了多种通路的调控,影响真菌的生长及形态的发生[6]。NO同样可以直接参与某些基因的转录，参与调节细胞氧化压力、蛋白质的修饰等生理生化进程[7]。目前研究表明，硝酸还原酶（NR）和亚硝酸还原酶（NiR）对初级氮的同化起主要作用，NR/NiR是胞内产生NO的主要途径之一[8]。本实验室在之前的研究中发现：在茉莉酸甲酯处理下，灵芝体内ROS及NO水平提高，同时可以影响其次生代谢及三萜类物质合成，且NO作为重要的信号分子与ROS之间有互作。同时，在之前的研究中Cu2+也可以使得ROS与NO的含量提高[9]。那么，NO能否作为重要的信号分子，参与灵芝的生理生化进程的调控?
Cu2+是生态环境中主要的金属元素之一，随人类活动进入环境中[10]。在植物研究中，已有研究表明Cu2+能对植物体内各种酶的生理生化活性产生影响[11]，能够抑制一些淀粉酶和葡萄糖苷酶的合成 [12]，从而对植物的正常生长产生较大影响。而此前对真菌受Cu2+变化影响的分子机制报道并不是很多，故本课题欲探讨Cu2+胁迫下的NO信号变化对灵芝合成代谢的影响。通过研究在不同浓度Cu2+胁迫下，野生型以及NR、NiR基因沉默菌株胞内的NO含量变化、灵芝三萜含量、生长速度，相关基因表达量等，确定NO信号在Cu2+胁迫灵芝菌丝生长中的作用，初步建立Cu2+胁迫、NO信号转导、灵芝合成代谢的相关模型。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 供试菌株 野生型灵芝菌种（WT）、空载体灵芝菌株（CK）、NR基因沉默灵芝菌株（NR6/NR8）、NiR基因沉默菌株(NiR16/NiR17)，保存于大学生命科学学院应用真菌实验室。
1．1．3 CYM培养基 液体培养基：葡萄糖20 g，胰蛋白胨2 g，酵母粉2 g，KH2PO4 0.46 g, K2HPO4 1 g，MgSO4 0.5 g，定容至1000 mL，在115 ℃下灭菌30 min后使用。固体培养基：将1%琼脂加入液体培养基中，115 ℃下灭菌30 min后使用。
1．1．3 主要试剂与溶液
1．1．3．1 主要试剂 冰醋酸、高氯酸、95%乙醇、香兰素、DCF2DA探针、齐墩果酸、一氧化氮检测试剂盒（南京建成科技有限公司）。
1．1．3．2 主要溶液 香草醛：将0.5 g香兰素加入10 mL冰醋酸溶解即可制备香草醛。 2.5M Cu2+原液：将21.31 g二水合氯化铜粉末加入50 mL去离子水中充分溶解，并用过滤除菌后使用2 mL离心管分装，保存于4 ℃冰箱待用。
1．1．4 主要仪器设备 28 ℃恒温培养箱、烘箱、分析天平、天平、小型种子打碎机、摇床、低温高速离心机、超声波清洗仪、无菌超净台、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅、722可见分光光度计、酶标仪、荧光显微镜等。
1．2 方法
1．2．1 菌种平板活化 将斜面培养基保存的母种接种至平板培养基上，置于28 ℃恒温培养至菌丝长满平板。
1．2．2 液体种子摇瓶培养 选取生长较好的活化平板，用Ф=6 mm的无菌打孔器在其上打孔，将9块母种接种于装有100 mL CYM液体培养基的三角瓶中，28 ℃摇床，150 r/min，培养7天。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key words 2
引言 2
1 材料与方法 3
1．1 材料 3
1．1．1 供试菌株 3
1．1．2 CYM培养基的配置 3
1．1．3 主要试剂与溶液 3
1．1．4 主要仪器设备 3
1．2 方法 3
1．2．1 菌种平板活化 3
1．2．2 液体种子摇瓶培养 3
1．2．3 不同浓度Cu2+CYM培养基的配制 3
1．2．4 二次摇瓶发酵培养 3
1．2．5 灵芝菌丝生长情况测定 4
1．2．6 灵芝三萜含量的测定 4
1．2．7 胞内NO含量检测 4
2 结果与分析 4
2．1 Cu2+胁迫对野生型灵芝三萜含量、菌丝生长速度的影响 4
2．2 Cu2+胁迫下野生型菌株胞内NO含量变化 5
2．3 Cu2+胁迫下NR和NiR基因沉默型灵芝菌株平板生长以及生长速度变化 5
2．4 NO含量在Cu2+胁迫下NR和NiR基因沉默型灵芝菌丝中的变化 6
2．4．1 DCF2DA荧光探针检测胞内NO含量 6
2．4．2 NO定量试剂盒检测胞内NO含量 7
2．5 Cu2+胁迫下NR和NiR基因沉默型菌株灵芝三萜合成情况 8
3 讨论 9
致谢：
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
9
参考文献： 10
NO对Cu2+胁迫下的灵芝生长代谢的影响
引言
引言
近年来，国内外学者对灵芝的化学、药理及临床效果等方面进行了研究，目前已从灵芝中分离得到160多种化合物，其中三萜类化合物具有显著的生理活性，是灵芝的主要药用成分[1,2]。大量的实验证明灵芝三萜类化合物具有抗肿瘤、降血压、降血脂、抗过敏和保肝等功能[3,4]。
自1982年Kubota.T首次从赤灵芝中分离得到三萜类化合物以来，国内外研究者对灵芝中三萜类化合物的提取、分离和结构鉴定进行了很多研究，先后从灵芝子实体及孢子中分离出100多种三萜类化合物，其结构均为高度氧化的羊毛甾烷衍生物。因三萜类化合物是灵芝发挥治疗作用的关键，灵芝中三萜类物质含量的多少决定了灵芝药效的高低。故在目前灵芝中三萜含量还较低的情况下，提高灵芝三萜含量，成为进一步提高灵芝的药用价值的重要问题。
作为在1992年被Science杂志评定的“年度分子”，一氧化氮（nitric oxide，NO）已成为当今胞内信号转导的热点之一。有实验证明NO可以广泛参与动物体内众多的生理、病理过程， 在生殖系统、神经系统、免疫系统等各个系统中都具有重要作用[5]。在真菌中，关于NO的研究发现，真菌细胞可以主动地通过生物合成途径生成NO，这种有目的性的NO合成表明了NO在真菌中发挥着重要的生物学作用。NO可以激活环鸟苷酸的合成，而环鸟苷酸是一种重要的第二信使分子参与了多种通路的调控,影响真菌的生长及形态的发生[6]。NO同样可以直接参与某些基因的转录，参与调节细胞氧化压力、蛋白质的修饰等生理生化进程[7]。目前研究表明，硝酸还原酶（NR）和亚硝酸还原酶（NiR）对初级氮的同化起主要作用，NR/NiR是胞内产生NO的主要途径之一[8]。本实验室在之前的研究中发现：在茉莉酸甲酯处理下，灵芝体内ROS及NO水平提高，同时可以影响其次生代谢及三萜类物质合成，且NO作为重要的信号分子与ROS之间有互作。同时，在之前的研究中Cu2+也可以使得ROS与NO的含量提高[9]。那么，NO能否作为重要的信号分子，参与灵芝的生理生化进程的调控?
Cu2+是生态环境中主要的金属元素之一，随人类活动进入环境中[10]。在植物研究中，已有研究表明Cu2+能对植物体内各种酶的生理生化活性产生影响[11]，能够抑制一些淀粉酶和葡萄糖苷酶的合成 [12]，从而对植物的正常生长产生较大影响。而此前对真菌受Cu2+变化影响的分子机制报道并不是很多，故本课题欲探讨Cu2+胁迫下的NO信号变化对灵芝合成代谢的影响。通过研究在不同浓度Cu2+胁迫下，野生型以及NR、NiR基因沉默菌株胞内的NO含量变化、灵芝三萜含量、生长速度，相关基因表达量等，确定NO信号在Cu2+胁迫灵芝菌丝生长中的作用，初步建立Cu2+胁迫、NO信号转导、灵芝合成代谢的相关模型。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 供试菌株 野生型灵芝菌种（WT）、空载体灵芝菌株（CK）、NR基因沉默灵芝菌株（NR6/NR8）、NiR基因沉默菌株(NiR16/NiR17)，保存于大学生命科学学院应用真菌实验室。
1．1．3 CYM培养基 液体培养基：葡萄糖20 g，胰蛋白胨2 g，酵母粉2 g，KH2PO4 0.46 g, K2HPO4 1 g，MgSO4 0.5 g，定容至1000 mL，在115 ℃下灭菌30 min后使用。固体培养基：将1%琼脂加入液体培养基中，115 ℃下灭菌30 min后使用。
1．1．3 主要试剂与溶液
1．1．3．1 主要试剂 冰醋酸、高氯酸、95%乙醇、香兰素、DCF2DA探针、齐墩果酸、一氧化氮检测试剂盒（南京建成科技有限公司）。
1．1．3．2 主要溶液 香草醛：将0.5 g香兰素加入10 mL冰醋酸溶解即可制备香草醛。 2.5M Cu2+原液：将21.31 g二水合氯化铜粉末加入50 mL去离子水中充分溶解，并用过滤除菌后使用2 mL离心管分装，保存于4 ℃冰箱待用。
1．1．4 主要仪器设备 28 ℃恒温培养箱、烘箱、分析天平、天平、小型种子打碎机、摇床、低温高速离心机、超声波清洗仪、无菌超净台、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅、722可见分光光度计、酶标仪、荧光显微镜等。
1．2 方法
1．2．1 菌种平板活化 将斜面培养基保存的母种接种至平板培养基上，置于28 ℃恒温培养至菌丝长满平板。
1．2．2 液体种子摇瓶培养 选取生长较好的活化平板，用Ф=6 mm的无菌打孔器在其上打孔，将9块母种接种于装有100 mL CYM液体培养基的三角瓶中，28 ℃摇床，150 r/min，培养7天。
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