拟南芥重金属转运蛋白的克隆及其金属抗性的筛选
：随着工农业的加速发展，重金属污染日益严重。过量的重金属不仅严重破坏生态环境，而且通过食物链的传递和积累最终危害人类健康。在植物中，一系列重金属转运蛋白基因被发现，越来越多的研究证明其在重金属吸收和解毒中起着关键的作用。本文围绕拟南芥的重金属转运蛋白基因（ZnT-4、Vps29）展开研究，已利用RT-PCR技术从拟南芥中克隆出ZnT-4基因以及Vps29基因；且将成功构建的目的基因表达载体转化到酵母中进行异源酵母功能互补实验，推断出ZnT-4基因可能对镉、铜、钴、锌、镍重金属没有抗性。本研究获得的成果将进一步丰富对于拟南芥重金属转运蛋白基因的相关认识，同时也为解决重金属污染的进一步研究奠定了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1 植物材料、菌种、试剂2
1.1.1植物材料及处理2
1.1.2菌种与载体2
1.1.3酶与试剂2
1.2 拟南芥ZnT4、Vps29基因的克隆及检测分析2
1.2.1引物设计3
1.2.2拟南芥总RNA提取3
1.2.3 cDNA的合成3
1.2.4引物最适退火温度的测定3
1.2.5目的基因的扩增4
1.2.6目的片段的回收及连接T载体4
1.2.7连接产物转化大肠杆菌4
1.2.8转化大肠杆菌阳性克隆的鉴定及测序4
1.3目的基因表达载体的构建及检测5
1.4重组质粒转化酵母细胞6
1.4.1酵母感受态的制备6
1.4.2重组质粒的酵母转化6
1.5异源酵母功能互补实验6
2结果与分析7
2.1拟南芥ZnT4、Vps29基因的克隆及检测结果7
2.1.1引物设计结果7
2.1.2最适退火温度的测定7
2.1.3 ZnT4基因、Vps29基因cDNA全长扩增7
2.2酶切检测7
2.3异源酵母功能互补实验结果8
3
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
讨论9
致谢10
参考文献10
拟南芥重金属转运蛋白的克隆及其金属抗性的筛选
引言
引言 重金属一般是指比重大于5的金属元素，如镉、铜、铅、铁、锌、钴、镍等[1]。重金属元素主要存在于地壳岩石中，但因工农业的飞速发展，如三废排放、农药化肥乱用等一系列人类活动使大量的重金属污染物进入土壤、水源等环境，重金属污染日益严重[2]。重金属污染对植物的损害是巨大的，过量的重金属会伤害根系、促使细胞异常分裂、损伤细胞膜系统、破坏植物叶绿体系统、使植物的生长代谢发生紊乱，甚至会直接导致植物死亡[35]；重金属污染同样危害人类健康，其通过在食物链上的传递和富集，进入人体后破坏机体的生理平衡，从而导致各种疾病如慢性中毒、致癌、致畸等[6]。重金属污染因其隐蔽性、稳定性、范围广、持续时间长、累积性等特点[7]，不仅对生态环境、人体健康造成严重的破坏，而且给我国的经济带来极大的损失[8]，因此解决重金属污染问题迫在眉睫。
现阶段重金属修复手段主要有三种：物理修复、化学修复和生物修复[7]。因物理和化学修复周期短，操作相对简单，在我国被广泛使用。但其产生了更加严重的副作用，如在物理，化学修复后的土地出现土壤结构破坏，土地肥力下降等情况。为有效缓解我国土地重金属严重污染的状况，重金属修复技术亟需着眼于生物修复的研究，特别是植物修复，因其低成本、无二次污染等优势，可以逐步取代物理和化学修复，成为更加环保有效的重金属修复手段[910]。随着分子生物学的不断进步，现已发现重金属转运蛋白为植物修复的核心。重金属转运蛋白分为吸收蛋白和排出蛋白两大类，它们在整个调控过程中发挥关键作用，参与了吸收、螯合、区室化和代谢利用等关键步骤[1112]，有效对环境中的重金属进行吸收，转运和解毒。
随着现代分子生物的不断进步和发展，一系列的重金属转运蛋白及基因陆续的被科学家们分离出，包括ZIP家族、ABC载体、金属S蛋白基因MT等等[1314]。锌铁蛋白 (ZIP)家族属于重金属吸收蛋白，拟南芥ZIP基因（ZIP1、ZIP2和ZIP3）可以使酵母Zn2+缺失突变体恢复吸收和转运Zn2+，使其恢复正常生长[15]，现已经发现ZIP基因存在各种生物中。ABC载体属于重金属排出蛋白，拟南芥ABC载体家族中AtMRP3的转录水平增高后表现出对Cd2+更高的耐受力[16]，已知的植物ABC转运蛋白均与抗逆和重金属解毒有关。MTlike蛋白及其基因也能明显提高植物对重金属的耐性[13]。等等。目前越来越多的研究证明植物重金属转运蛋白具有解毒能力，众多重金属转运蛋白基因的发现和克隆，为进一步探索植物修复的分子机制提供了最基本的条件。
拟南芥是一种典型的模式植物，是本研究重要的研究材料。它具有诸多优点，如生长周期短，易于在实验室条件下栽培培养；基因组小且简单，已经实现全序列分析；转化操作简单且成功率高；易于诱变且便于筛选目标突变体等等，在植物以及分子生物学的研究中被广泛应用。同时，科学家们在拟南芥上取得的研究成果可以为研究其他高等植物提供方向，这对揭示植物生长发育规律具有重大的意义[17]。
本课题将从拟南芥中克隆锌转运体4前体（ZnT4）、钙调神经磷酸酶类金属磷酸酯酶超家族蛋白（Vps29）等重金属转运蛋白基因，构建重金属转运蛋白基因的表达载体，在异源酵母功能互补实验的基础上，筛选其金属抗性，为解决重金属污染研究奠定基础。
1 材料与方法
1．1 植物材料、菌种、试剂
1．1．1 植物材料及处理
基因来源于拟南芥，拟南芥种子为实验室保存。拟南芥种子用70%酒精浸泡30s，10%NaClO消毒10min，在超净工作台上用无菌水冲洗68次后接入MS基本培养基上，4℃条件下避光春化24d后，转至光照培养，在25℃、16h光照下培养。当幼苗长到14d时，选择适当的拟南芥植株，取其叶片作为实验材料[18]。
1．1．2 菌种与载体
大肠杆菌E.coli DH5α、野生型酵母菌株（YOD）、金属敏感型酵母突变株（△ycf1、△cup1、△cot1、△zrc1、△smf1）；克隆载体pMD19T、表达载体pYES2；载体抗性（Amp）。
1．1．3 酶与试剂
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1 植物材料、菌种、试剂2
1.1.1植物材料及处理2
1.1.2菌种与载体2
1.1.3酶与试剂2
1.2 拟南芥ZnT4、Vps29基因的克隆及检测分析2
1.2.1引物设计3
1.2.2拟南芥总RNA提取3
1.2.3 cDNA的合成3
1.2.4引物最适退火温度的测定3
1.2.5目的基因的扩增4
1.2.6目的片段的回收及连接T载体4
1.2.7连接产物转化大肠杆菌4
1.2.8转化大肠杆菌阳性克隆的鉴定及测序4
1.3目的基因表达载体的构建及检测5
1.4重组质粒转化酵母细胞6
1.4.1酵母感受态的制备6
1.4.2重组质粒的酵母转化6
1.5异源酵母功能互补实验6
2结果与分析7
2.1拟南芥ZnT4、Vps29基因的克隆及检测结果7
2.1.1引物设计结果7
2.1.2最适退火温度的测定7
2.1.3 ZnT4基因、Vps29基因cDNA全长扩增7
2.2酶切检测7
2.3异源酵母功能互补实验结果8
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*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
讨论9
致谢10
参考文献10
拟南芥重金属转运蛋白的克隆及其金属抗性的筛选
引言
引言 重金属一般是指比重大于5的金属元素，如镉、铜、铅、铁、锌、钴、镍等[1]。重金属元素主要存在于地壳岩石中，但因工农业的飞速发展，如三废排放、农药化肥乱用等一系列人类活动使大量的重金属污染物进入土壤、水源等环境，重金属污染日益严重[2]。重金属污染对植物的损害是巨大的，过量的重金属会伤害根系、促使细胞异常分裂、损伤细胞膜系统、破坏植物叶绿体系统、使植物的生长代谢发生紊乱，甚至会直接导致植物死亡[35]；重金属污染同样危害人类健康，其通过在食物链上的传递和富集，进入人体后破坏机体的生理平衡，从而导致各种疾病如慢性中毒、致癌、致畸等[6]。重金属污染因其隐蔽性、稳定性、范围广、持续时间长、累积性等特点[7]，不仅对生态环境、人体健康造成严重的破坏，而且给我国的经济带来极大的损失[8]，因此解决重金属污染问题迫在眉睫。
现阶段重金属修复手段主要有三种：物理修复、化学修复和生物修复[7]。因物理和化学修复周期短，操作相对简单，在我国被广泛使用。但其产生了更加严重的副作用，如在物理，化学修复后的土地出现土壤结构破坏，土地肥力下降等情况。为有效缓解我国土地重金属严重污染的状况，重金属修复技术亟需着眼于生物修复的研究，特别是植物修复，因其低成本、无二次污染等优势，可以逐步取代物理和化学修复，成为更加环保有效的重金属修复手段[910]。随着分子生物学的不断进步，现已发现重金属转运蛋白为植物修复的核心。重金属转运蛋白分为吸收蛋白和排出蛋白两大类，它们在整个调控过程中发挥关键作用，参与了吸收、螯合、区室化和代谢利用等关键步骤[1112]，有效对环境中的重金属进行吸收，转运和解毒。
随着现代分子生物的不断进步和发展，一系列的重金属转运蛋白及基因陆续的被科学家们分离出，包括ZIP家族、ABC载体、金属S蛋白基因MT等等[1314]。锌铁蛋白 (ZIP)家族属于重金属吸收蛋白，拟南芥ZIP基因（ZIP1、ZIP2和ZIP3）可以使酵母Zn2+缺失突变体恢复吸收和转运Zn2+，使其恢复正常生长[15]，现已经发现ZIP基因存在各种生物中。ABC载体属于重金属排出蛋白，拟南芥ABC载体家族中AtMRP3的转录水平增高后表现出对Cd2+更高的耐受力[16]，已知的植物ABC转运蛋白均与抗逆和重金属解毒有关。MTlike蛋白及其基因也能明显提高植物对重金属的耐性[13]。等等。目前越来越多的研究证明植物重金属转运蛋白具有解毒能力，众多重金属转运蛋白基因的发现和克隆，为进一步探索植物修复的分子机制提供了最基本的条件。
拟南芥是一种典型的模式植物，是本研究重要的研究材料。它具有诸多优点，如生长周期短，易于在实验室条件下栽培培养；基因组小且简单，已经实现全序列分析；转化操作简单且成功率高；易于诱变且便于筛选目标突变体等等，在植物以及分子生物学的研究中被广泛应用。同时，科学家们在拟南芥上取得的研究成果可以为研究其他高等植物提供方向，这对揭示植物生长发育规律具有重大的意义[17]。
本课题将从拟南芥中克隆锌转运体4前体（ZnT4）、钙调神经磷酸酶类金属磷酸酯酶超家族蛋白（Vps29）等重金属转运蛋白基因，构建重金属转运蛋白基因的表达载体，在异源酵母功能互补实验的基础上，筛选其金属抗性，为解决重金属污染研究奠定基础。
1 材料与方法
1．1 植物材料、菌种、试剂
1．1．1 植物材料及处理
基因来源于拟南芥，拟南芥种子为实验室保存。拟南芥种子用70%酒精浸泡30s，10%NaClO消毒10min，在超净工作台上用无菌水冲洗68次后接入MS基本培养基上，4℃条件下避光春化24d后，转至光照培养，在25℃、16h光照下培养。当幼苗长到14d时，选择适当的拟南芥植株，取其叶片作为实验材料[18]。
1．1．2 菌种与载体
大肠杆菌E.coli DH5α、野生型酵母菌株（YOD）、金属敏感型酵母突变株（△ycf1、△cup1、△cot1、△zrc1、△smf1）；克隆载体pMD19T、表达载体pYES2；载体抗性（Amp）。
1．1．3 酶与试剂
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