邻苯二甲酸双加氧酶基因克隆表达及其粗酶酶学特性的研究
邻苯二甲酸双加氧酶（phthalate dioxygenase，PDO）是邻苯二甲酸酯生物降解过程中的一个关键酶。邻苯二甲酸酯降解的中间产物邻苯二甲酸能在PDO的作用下开环，通过一系列的反应进入三羧酸循环，最终实现完全降解。本实验通过特定的扩增引物，从邻苯二甲酸二丁酯降解菌株Pseudomonas sp.strain QY-1中克隆得到编码邻苯二甲酸双加氧酶的基因pdy，大小约为950bp。利用扩增载体和表达载体实现pdy在大肠杆菌BL21（DE3）中的异源表达，然后纯化表达产物，获得纯酶,大小约为36.9kDa。我们还探究了该邻苯二甲酸双加氧酶粗酶的最适反应温度和pH，结果表明粗酶分别在pH为7.0和35℃的条件下相对酶活力最高。
目录
摘 要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引 言2
1 材料与方法3
1.1 培养基与试剂盒3
1.1.1 培养基配方3
1.1.2 所用试剂盒3
1.2 所用菌株、质粒与引物4
1.3 邻苯二甲酸双加氧酶基因pdy的克隆4
1.4 表达载体的构建5
1.5 重组菌的诱导表达和蛋白纯化6
1.5.1 重组菌株的诱导表达6
1.5.2 粗酶的制备6
1.5.3 目的蛋白的纯化6
1.5.4 SDSPAGE凝胶电泳检测7
1.6 邻苯二甲酸双加氧酶PDO酶学特性的研究7
1.6.1 邻苯二甲酸双加氧酶PDO的最适反应温度7
1.6.2 邻苯二甲酸双加氧酶PDO的最适反应pH7
2结果与分析7
2.1 邻苯二甲酸双加氧酶PDO的异源表达及纯化7
2.1.1 PCR扩增pdy及表达载体的构建7
2.1.2 邻苯二甲酸双加氧酶PDO的异源表达8
2.2 邻苯二甲酸双加氧酶PDO的酶学特性9
3讨论10
致谢10
参考文献11
邻苯二甲酸双加氧酶基因克隆及其粗酶酶学特性的研究
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
邻苯二甲酸酯（phthalate esters，PAEs）是邻苯二甲酸和不同的醇类酯化形成的一类酯类化合物。邻苯二甲酸酯种类繁多，具有增塑的作用，广泛应用于塑料制品中。例如常用的聚氯乙烯塑料, 在重量上含有2050%的邻苯二甲酸酯[1]。很多人类日常生活中经常使用的商品如食品、化妆品、玩具、润滑剂、去泡剂、农药载医药材料都被检出含有PAEs。
邻苯二甲酸酯的广泛使用给大气、水体、土壤均带来了大量的污染[2]。其中主要的危害是PEAs对生物的内分泌的干扰。邻苯二甲酸酯可以由不同的渠道给环境带来污染，它们可以通过饮用水、生物富集等多种方式影响人或其他生物的内分泌系统，造成内分泌紊乱，从而危害健康。研究表明，邻苯二甲酸酯可以通过哺乳期女性的乳汁影响婴幼儿的内分泌系统[3]，邻苯二甲酸单酯会影响孕烷X受体的形成，从而表现出内分泌干扰性[4]。?inel K?ksal等人以小鼠为研究对象发现邻苯二甲酸丁基环己酯（BCP）不仅能够抑制其成纤维细胞的生长，还会造成DNA的损伤，具有潜在的遗传毒性[5]。此外，PEAs还对水生生物有毒害作用，研究人员研究了18种PAES对水生生物的毒害（细菌藻类原生动物等），结果显示分子量小的PAEs毒害作用更加明显[6]。
由于邻苯二甲酸酯污染在自然界中广泛存在，所以研究人员一直在探究降解邻苯二甲酸酯的各种办法。一般而言，污染物在环境中降解的方式主要是三种，分别为物理方法、化学方法、微生物方法。其中，微生物降解被认为是降解PAEs最有效的办法。目前已经以不同PAEs为唯一碳源筛选到了Gordonia sp. strain Dop5[7]、Rhodococcus ruber strain DP2[8]、Gordonia sp. Strain MTCC 4818[9]、Gordonia sp. strain QH11[10]、Bacillus subtilis strain 3C3[11]等多种PAEs的高效降解菌。同时，PAEs的微生物降解途径也被人们所探知。曾锋等人通过实验发现，Pseudomonas fluorescens FS1胞内的邻苯二甲酸酯降解酶可以将邻苯二甲酸二丁酯降解为邻苯二甲酸单酯，进而降解成邻苯二甲酸[12]。Li,Yan等人通过高效液相色谱的方法确定了菌株HSNH1降解PAEs主要的中间产物邻苯二甲酸(PA)和原儿茶酸（PCA），又通过基因组分析方法找到了从PA转化成PCA过程中作用的基因簇。进一步的分析发现该基因簇编码了一个邻苯二甲酸3，4双加氧酶，该酶就是促使PA向PCA转化的关键酶[13]。之后，这些中间产物在脱羧酶和脱氢酶的作用下进一步降解，最终通过三羧酸循环彻底降解为水和二氧化碳。
邻苯二甲酸在邻苯二甲酸双加氧酶（phthalate dioxygenase，PDO）的作用下实现开环，从而使PAEs能够彻底降解。Wang等人发现当施加邻苯二甲酸二丁酯（DBP）时Arthrobacter sp. ZH2的3，4邻苯二甲酸双加氧酶基因的表达量大幅增长[14]。这说明PDO是实现PAEs微生物高效降解的至关重要的一种酶。目前的研究发现，PDO与其他的加氧酶一样属于Rieske型非血红素铁加氧酶，有类似的催化功能，但是其结构与大多数加氧酶并不相同，PDO仅由α亚基构成，而多数加氧酶是由α和β两种亚基构成[15]。另外，人们已经对PDO进行了分子水平的研究，Wu等从河泥中分离到4株Gordonia sp.并从中克隆到了3,4邻苯二甲酸双加氧酶基因[16]。还有研究人员从Burkholderia cepacia中克隆了邻苯二甲酸双加氧酶基因，并将其导入大肠杆菌表达并探索了不同pH对PDO表达的影响[17]。
目录
摘 要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引 言2
1 材料与方法3
1.1 培养基与试剂盒3
1.1.1 培养基配方3
1.1.2 所用试剂盒3
1.2 所用菌株、质粒与引物4
1.3 邻苯二甲酸双加氧酶基因pdy的克隆4
1.4 表达载体的构建5
1.5 重组菌的诱导表达和蛋白纯化6
1.5.1 重组菌株的诱导表达6
1.5.2 粗酶的制备6
1.5.3 目的蛋白的纯化6
1.5.4 SDSPAGE凝胶电泳检测7
1.6 邻苯二甲酸双加氧酶PDO酶学特性的研究7
1.6.1 邻苯二甲酸双加氧酶PDO的最适反应温度7
1.6.2 邻苯二甲酸双加氧酶PDO的最适反应pH7
2结果与分析7
2.1 邻苯二甲酸双加氧酶PDO的异源表达及纯化7
2.1.1 PCR扩增pdy及表达载体的构建7
2.1.2 邻苯二甲酸双加氧酶PDO的异源表达8
2.2 邻苯二甲酸双加氧酶PDO的酶学特性9
3讨论10
致谢10
参考文献11
邻苯二甲酸双加氧酶基因克隆及其粗酶酶学特性的研究
引言
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邻苯二甲酸酯（phthalate esters，PAEs）是邻苯二甲酸和不同的醇类酯化形成的一类酯类化合物。邻苯二甲酸酯种类繁多，具有增塑的作用，广泛应用于塑料制品中。例如常用的聚氯乙烯塑料, 在重量上含有2050%的邻苯二甲酸酯[1]。很多人类日常生活中经常使用的商品如食品、化妆品、玩具、润滑剂、去泡剂、农药载医药材料都被检出含有PAEs。
邻苯二甲酸酯的广泛使用给大气、水体、土壤均带来了大量的污染[2]。其中主要的危害是PEAs对生物的内分泌的干扰。邻苯二甲酸酯可以由不同的渠道给环境带来污染，它们可以通过饮用水、生物富集等多种方式影响人或其他生物的内分泌系统，造成内分泌紊乱，从而危害健康。研究表明，邻苯二甲酸酯可以通过哺乳期女性的乳汁影响婴幼儿的内分泌系统[3]，邻苯二甲酸单酯会影响孕烷X受体的形成，从而表现出内分泌干扰性[4]。?inel K?ksal等人以小鼠为研究对象发现邻苯二甲酸丁基环己酯（BCP）不仅能够抑制其成纤维细胞的生长，还会造成DNA的损伤，具有潜在的遗传毒性[5]。此外，PEAs还对水生生物有毒害作用，研究人员研究了18种PAES对水生生物的毒害（细菌藻类原生动物等），结果显示分子量小的PAEs毒害作用更加明显[6]。
由于邻苯二甲酸酯污染在自然界中广泛存在，所以研究人员一直在探究降解邻苯二甲酸酯的各种办法。一般而言，污染物在环境中降解的方式主要是三种，分别为物理方法、化学方法、微生物方法。其中，微生物降解被认为是降解PAEs最有效的办法。目前已经以不同PAEs为唯一碳源筛选到了Gordonia sp. strain Dop5[7]、Rhodococcus ruber strain DP2[8]、Gordonia sp. Strain MTCC 4818[9]、Gordonia sp. strain QH11[10]、Bacillus subtilis strain 3C3[11]等多种PAEs的高效降解菌。同时，PAEs的微生物降解途径也被人们所探知。曾锋等人通过实验发现，Pseudomonas fluorescens FS1胞内的邻苯二甲酸酯降解酶可以将邻苯二甲酸二丁酯降解为邻苯二甲酸单酯，进而降解成邻苯二甲酸[12]。Li,Yan等人通过高效液相色谱的方法确定了菌株HSNH1降解PAEs主要的中间产物邻苯二甲酸(PA)和原儿茶酸（PCA），又通过基因组分析方法找到了从PA转化成PCA过程中作用的基因簇。进一步的分析发现该基因簇编码了一个邻苯二甲酸3，4双加氧酶，该酶就是促使PA向PCA转化的关键酶[13]。之后，这些中间产物在脱羧酶和脱氢酶的作用下进一步降解，最终通过三羧酸循环彻底降解为水和二氧化碳。
邻苯二甲酸在邻苯二甲酸双加氧酶（phthalate dioxygenase，PDO）的作用下实现开环，从而使PAEs能够彻底降解。Wang等人发现当施加邻苯二甲酸二丁酯（DBP）时Arthrobacter sp. ZH2的3，4邻苯二甲酸双加氧酶基因的表达量大幅增长[14]。这说明PDO是实现PAEs微生物高效降解的至关重要的一种酶。目前的研究发现，PDO与其他的加氧酶一样属于Rieske型非血红素铁加氧酶，有类似的催化功能，但是其结构与大多数加氧酶并不相同，PDO仅由α亚基构成，而多数加氧酶是由α和β两种亚基构成[15]。另外，人们已经对PDO进行了分子水平的研究，Wu等从河泥中分离到4株Gordonia sp.并从中克隆到了3,4邻苯二甲酸双加氧酶基因[16]。还有研究人员从Burkholderia cepacia中克隆了邻苯二甲酸双加氧酶基因，并将其导入大肠杆菌表达并探索了不同pH对PDO表达的影响[17]。
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