百菌清水解脱氯酶工业化发酵培养基的初步研究
：实验选取了糖蜜、玉米浆以及发酵废水等工业生产副产物，替代已有培养基中的碳氮源及发酵用水，以降低百菌清水解脱氯酶的发酵成本，并研究了发酵制备酶液对蔬菜、水果表面百菌清的降解效果。结果表明糖蜜及玉米浆的替代比例分别为5%及100%时可以保证相同的发酵水平。室温下酶液浸泡2小时后，蔬菜及水果表面百菌清含量可分别降低82.9%和89.5%。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key words 2
引言： 2
1 材料与方法 3
1.1 材料 3
1.1.1 供试菌株 3
1.1.2 培养基 3
1.1.3 主要试剂与材料 3
1.1.4 主要仪器 3
1.2 方法 3
1.2.1 改进培养基的配制 3
1.2.2 菌种平板活化 3
1.2.3 种子液及发酵培养基的培养 3
1.2.4 百菌清水解酶的酶活测定 3
1.2.5 生物量的测定 4
1.2.6 粗酶液初步纯化 4
1.2.7 Chd蛋白表达量检测 4
1.2.8 糖蜜的处理方法 4
1.2.9 处理糖蜜还原糖、总糖的测定 4
1.2.10 发酵水回用 5
1.2.11 蔬菜、水果表面农药残留降解能力检测 5
2 结果与分析 5
2.1 标准曲线 5
2.1.1 百菌清含量标准曲线 5
2.1.2 葡萄糖标准曲线及处理糖蜜还原糖、总糖的测定 5
2.1.3 考马斯亮蓝蛋白定量标准曲线 6
2.2 优化替代培养基发酵结果 6
2.2.1 糖蜜替代碳源实验 6
2.2.2 玉米浆替代氮源实验 7
2.2.3 混合替代实验 8
2.3 Chd蛋白表达量检测 9
2.4 发酵水回用 10
2.5 蔬菜、水果表面农药残留降解能力检测 11
2.5.1 水果表面农药残留降解能力检测（以草
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莓为代表） 11
2.5.2 蔬菜表面农药残留降解能力检测（以卷心菜为代表） 12
3 讨论 14
3.1 优化替代培养基 14
3.2 发酵水的应用 14
3.3 发酵酶液的应用 14
致谢： 14
参考文献： 15
百菌清水解脱氯酶工业化发酵培养基的初步研究
引言
引言
百菌清(四氯间苯二腈)是一种广谱、保护性杀菌剂，具有较大的黏着性，不易被雨水冲刷掉，药效期较长，对多种作物的真菌病害具有良好的预防作用[1]。百菌清对于鱼、鸟和水生无脊椎动物具有高毒性，在环境中具有累积效应。由于百菌清的广泛使用及难降解性，在环境中经常能检测到其农药残留。生物降解是去除百菌清农药残留的一种有效方法。酶制剂是一种从生物中提取的一类具有催化能力的蛋白质，具有高效性与专一性，并且安全、无毒。因此通过微生物制备百菌清水解酶酶制剂来降解百菌清是非常安全可靠且具有应用前景。本课题选用一株已构建好的产百菌清水解脱氯酶工程菌Bacillus subtilis WB800为实验菌株，在已优化的液态发酵培养基基础上，进一步改进培养基成分，以期达到降低生产成本的目的，从而为工业化生产制备酶百菌清水解脱氯酶酶制剂及其实际应用奠定基础。
糖蜜是制糖工业的主要副产物之一，含有大量糖分，且价格低廉。目前，国内已有用糖蜜为碳源生产黄原胶、海藻糖、L乳酸、柠檬酸、乳链菌肽的成功案例[27]，此外，也有研究证明糖蜜可作为小球藻培养的廉价碳源[8]。本课题将糖蜜进行预处理，考查其在工业发酵中代替碳源的可行性。玉米浆经常用作发酵工业的有机氮源，例如，一定量的玉米浆可作为有机氮源用于青霉素发酵，有利于提高发酵效价，并降低成本[9]。利用玉米浆作为有机氮源利用细菌发酵可生产L乳酸[10]。也有研究证实了多种玉米浆作为氮源替代酵母膏发酵产丁二酸的可行性[11]。选取玉米浆替代酵母粉、蛋白胨等昂贵氮源用于发酵。通过Bacillus subtilis WB800菌株发酵所产生的百菌清水解脱氯酶的酶活、生物量、蛋白表达量以考查其用作工业发酵培养基的可行性。
同时也研究证实同时运用糖蜜和玉米浆进行发酵，也可获得较大的产量[1213]。通过使用处理糖蜜与玉米浆分别替代已有Bacillus subtilis WB800(pP43Chd)菌株培养基中的碳源及有机氮源，可大幅度的降低成本，在工业化发酵中具有重要的意义，所生产的百菌清水解酶制剂可用于百菌清的降解，对环境具有一定的保护作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 重组枯草芽孢杆菌WB800(pP43Chd)，保存于大学生命科学学院农业环境微生物工程重点开放实验室。
1.1.2 培养基 已优化的液体培养基(初始培养基)：葡萄糖5%，胰蛋白胨3%，酵母粉3.9%，K2HPO4 0.3%，NaCl 0.3%，MgSO4 0.3%。115℃灭菌30 min。
1.1.3 主要试剂与材料 活性糖蜜(广西亚糖太古贸易有限公司)、玉米浆(干物质含量约38%)、二氯甲烷、无水硫酸钠、PBS缓冲液、DNS试剂(配制方法见1.2.9)。
1.1.4 主要仪器 37℃恒温培养箱、摇床、低温高速离心机、恒温水浴锅、扫描型紫外可见分光光度计、超净工作台、分析天平、电泳仪、烘箱。
1.2 方法
1.2.1 改进培养基的配制 a.在已有液体培养基的基础上将处理糖蜜按不同梯度替代葡萄糖，其余不变。b.在已有液体培养基的基础上将玉米浆按不同梯度替代比例替代酵母粉与蛋白胨，其余不变。c.运用a、b中所得的最适替代比例，即在已有液体培养基的基础上同时使用糖蜜及玉米浆进行替代。
1.2.2 菌种平板活化 将保存的菌种划线接种于加50 ppm卡那霉素的LB平板培养基上，置于37℃培养24 h。挑取平板中单菌落接种于加50 ppm卡那霉素和50 ppm百菌清(丙酮溶)的LB平板培养基上，置于37℃培养24 h，选取具有较大透明圈的菌落用于实验。
1.2.3 种子液及发酵培养基的培养 种子液及发酵培养基均为30 ml发酵体系置于250 ml三角瓶中。于37℃恒温摇床中，175 rpm培养。种子液选取已活化的菌种接种，在培养1012 h后以10%的接种量接种于发酵培养基中。发酵培养基摇瓶12 h后加20 ppm百菌清，诱导菌体产生百菌清水解酶，继续培养12 h后取样测量数据。
1.2.4 百菌清水解酶的酶活测定 发酵液12000 rpm，4℃离心10 min取上清液即为Chd酶液，取适宜量酶液用PBS缓冲液稀释至3 ml，加入50 ppm百菌清溶液(丙酮溶)，40℃水浴2 h，迅速取出用等体积二氯甲烷萃取百菌清终止反应，去水相，有机相加无水硫酸钠去除剩余水分。百菌清用扫描型紫外可见分光光度计200 nm300 nm扫描时可在234 nm左右处出现最高峰，故可制作百菌清含量标准曲线，以此测量反应剩余的百菌清含量，计算酶活。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key words 2
引言： 2
1 材料与方法 3
1.1 材料 3
1.1.1 供试菌株 3
1.1.2 培养基 3
1.1.3 主要试剂与材料 3
1.1.4 主要仪器 3
1.2 方法 3
1.2.1 改进培养基的配制 3
1.2.2 菌种平板活化 3
1.2.3 种子液及发酵培养基的培养 3
1.2.4 百菌清水解酶的酶活测定 3
1.2.5 生物量的测定 4
1.2.6 粗酶液初步纯化 4
1.2.7 Chd蛋白表达量检测 4
1.2.8 糖蜜的处理方法 4
1.2.9 处理糖蜜还原糖、总糖的测定 4
1.2.10 发酵水回用 5
1.2.11 蔬菜、水果表面农药残留降解能力检测 5
2 结果与分析 5
2.1 标准曲线 5
2.1.1 百菌清含量标准曲线 5
2.1.2 葡萄糖标准曲线及处理糖蜜还原糖、总糖的测定 5
2.1.3 考马斯亮蓝蛋白定量标准曲线 6
2.2 优化替代培养基发酵结果 6
2.2.1 糖蜜替代碳源实验 6
2.2.2 玉米浆替代氮源实验 7
2.2.3 混合替代实验 8
2.3 Chd蛋白表达量检测 9
2.4 发酵水回用 10
2.5 蔬菜、水果表面农药残留降解能力检测 11
2.5.1 水果表面农药残留降解能力检测（以草
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莓为代表） 11
2.5.2 蔬菜表面农药残留降解能力检测（以卷心菜为代表） 12
3 讨论 14
3.1 优化替代培养基 14
3.2 发酵水的应用 14
3.3 发酵酶液的应用 14
致谢： 14
参考文献： 15
百菌清水解脱氯酶工业化发酵培养基的初步研究
引言
引言
百菌清(四氯间苯二腈)是一种广谱、保护性杀菌剂，具有较大的黏着性，不易被雨水冲刷掉，药效期较长，对多种作物的真菌病害具有良好的预防作用[1]。百菌清对于鱼、鸟和水生无脊椎动物具有高毒性，在环境中具有累积效应。由于百菌清的广泛使用及难降解性，在环境中经常能检测到其农药残留。生物降解是去除百菌清农药残留的一种有效方法。酶制剂是一种从生物中提取的一类具有催化能力的蛋白质，具有高效性与专一性，并且安全、无毒。因此通过微生物制备百菌清水解酶酶制剂来降解百菌清是非常安全可靠且具有应用前景。本课题选用一株已构建好的产百菌清水解脱氯酶工程菌Bacillus subtilis WB800为实验菌株，在已优化的液态发酵培养基基础上，进一步改进培养基成分，以期达到降低生产成本的目的，从而为工业化生产制备酶百菌清水解脱氯酶酶制剂及其实际应用奠定基础。
糖蜜是制糖工业的主要副产物之一，含有大量糖分，且价格低廉。目前，国内已有用糖蜜为碳源生产黄原胶、海藻糖、L乳酸、柠檬酸、乳链菌肽的成功案例[27]，此外，也有研究证明糖蜜可作为小球藻培养的廉价碳源[8]。本课题将糖蜜进行预处理，考查其在工业发酵中代替碳源的可行性。玉米浆经常用作发酵工业的有机氮源，例如，一定量的玉米浆可作为有机氮源用于青霉素发酵，有利于提高发酵效价，并降低成本[9]。利用玉米浆作为有机氮源利用细菌发酵可生产L乳酸[10]。也有研究证实了多种玉米浆作为氮源替代酵母膏发酵产丁二酸的可行性[11]。选取玉米浆替代酵母粉、蛋白胨等昂贵氮源用于发酵。通过Bacillus subtilis WB800菌株发酵所产生的百菌清水解脱氯酶的酶活、生物量、蛋白表达量以考查其用作工业发酵培养基的可行性。
同时也研究证实同时运用糖蜜和玉米浆进行发酵，也可获得较大的产量[1213]。通过使用处理糖蜜与玉米浆分别替代已有Bacillus subtilis WB800(pP43Chd)菌株培养基中的碳源及有机氮源，可大幅度的降低成本，在工业化发酵中具有重要的意义，所生产的百菌清水解酶制剂可用于百菌清的降解，对环境具有一定的保护作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 重组枯草芽孢杆菌WB800(pP43Chd)，保存于大学生命科学学院农业环境微生物工程重点开放实验室。
1.1.2 培养基 已优化的液体培养基(初始培养基)：葡萄糖5%，胰蛋白胨3%，酵母粉3.9%，K2HPO4 0.3%，NaCl 0.3%，MgSO4 0.3%。115℃灭菌30 min。
1.1.3 主要试剂与材料 活性糖蜜(广西亚糖太古贸易有限公司)、玉米浆(干物质含量约38%)、二氯甲烷、无水硫酸钠、PBS缓冲液、DNS试剂(配制方法见1.2.9)。
1.1.4 主要仪器 37℃恒温培养箱、摇床、低温高速离心机、恒温水浴锅、扫描型紫外可见分光光度计、超净工作台、分析天平、电泳仪、烘箱。
1.2 方法
1.2.1 改进培养基的配制 a.在已有液体培养基的基础上将处理糖蜜按不同梯度替代葡萄糖，其余不变。b.在已有液体培养基的基础上将玉米浆按不同梯度替代比例替代酵母粉与蛋白胨，其余不变。c.运用a、b中所得的最适替代比例，即在已有液体培养基的基础上同时使用糖蜜及玉米浆进行替代。
1.2.2 菌种平板活化 将保存的菌种划线接种于加50 ppm卡那霉素的LB平板培养基上，置于37℃培养24 h。挑取平板中单菌落接种于加50 ppm卡那霉素和50 ppm百菌清(丙酮溶)的LB平板培养基上，置于37℃培养24 h，选取具有较大透明圈的菌落用于实验。
1.2.3 种子液及发酵培养基的培养 种子液及发酵培养基均为30 ml发酵体系置于250 ml三角瓶中。于37℃恒温摇床中，175 rpm培养。种子液选取已活化的菌种接种，在培养1012 h后以10%的接种量接种于发酵培养基中。发酵培养基摇瓶12 h后加20 ppm百菌清，诱导菌体产生百菌清水解酶，继续培养12 h后取样测量数据。
1.2.4 百菌清水解酶的酶活测定 发酵液12000 rpm，4℃离心10 min取上清液即为Chd酶液，取适宜量酶液用PBS缓冲液稀释至3 ml，加入50 ppm百菌清溶液(丙酮溶)，40℃水浴2 h，迅速取出用等体积二氯甲烷萃取百菌清终止反应，去水相，有机相加无水硫酸钠去除剩余水分。百菌清用扫描型紫外可见分光光度计200 nm300 nm扫描时可在234 nm左右处出现最高峰，故可制作百菌清含量标准曲线，以此测量反应剩余的百菌清含量，计算酶活。
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