泡菜水中益生乳酸菌的分离和鉴定泡菜水中益生乳酸菌的分离和鉴定【字数：7578】
乳酸菌可以发酵产生多种有机酸和益生物质，具有多种等益生特性，因此乳酸菌的资源开发、利用以及乳酸菌相关的药物的研究是研究的热点。本实验从泡菜水中分离筛选了一株具有益生特性的乳酸菌，并对它的生长特性、产酸能力、抑菌效果等生理生化特性进行研究。
目录
摘要 1
引言
引言
乳酸菌是革兰氏阳性菌，能够利用糖类发酵产生乳酸，是一种兼性厌氧或严格厌氧型细菌[1]。乳酸菌主要包括乳酸杆菌属、链球菌属、魏斯氏菌属、双歧杆菌属和明串珠球菌属等[2]。乳酸菌的代谢类型有糖酵解途径和磷酸戊糖途径，经过糖酵解路径发酵产生乳酸，为同型乳酸发酵，而由磷酸戊糖途径进行异型乳酸发酵，产物除乳酸外，还有乙醇、冰醋酸和 CO2 等[13]。植物乳杆菌、嗜热链球菌等进行同型乳酸发酵，而双歧杆菌、肠膜明串珠菌等为异型乳酸菌[13]。
乳酸菌在代谢的过程中能够产生许多不同的有机酸和益生活性物质，不仅能够改善食品和饲料的风味及营养，而且能够促进营养物质被人体和动物体吸收[1]。同时，有机酸形成的酸性环境以及乳酸菌产生的具有抑菌或杀菌效果的细菌素能够抑制有害微生物的生长，防止食物腐坏，延长食品保鲜期[68]。除了食品和饲料等传统领域，乳酸菌在医药领域也有巨大的应用前景[45,12]。研究显示，乳酸菌具有黏附在消化道粘膜，形成屏障排斥病原菌的定殖的特性，可以抑制消化道致病菌的生长，同时，乳酸菌的生理代谢能够刺激消化道免疫反应，提高宿主的免疫能力，而其代谢物能防治感染性和功能性消化道疾病，促进肠道的蠕动，达到润肠通便的效果[45]；乳酸菌还能够降解胆盐和对动物机体有害的亚硝酸盐，从而促进胆固醇的分解代谢，降低胆固醇，维护肠道的微生态的平衡，加强机体的一些免疫功能[5]。此外，乳酸菌还具有免疫治疗等益生特性，研发乳酸菌药物也是研究热点[4]。
目前，国内对乳酸菌的研究基本上集中于乳酸菌的分离筛选和生理生化特性分析应用，主要针对乳酸菌的产酸能力、对动物的可能的益生作用以及发酵产物对产品的影响方面。此外，一些乳酸菌的全基因组也已被测序，对乳酸菌DNA序列以及功能基因的研究也越来越深入[9,13,14]。这些研究对于乳酸菌生理生化特性研究以及功能基因研究，对乳酸菌资源进行充分利用，起到了非常重要的作用。
由于乳酸菌是 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
人体和动物体内消化道的优势菌群，对人体和动物体无害，因此在食品、医疗和饲料领域有着重要的研究前景[10,11]。因此，分离筛选发酵能力优良的乳酸菌对改良发酵产品，开发相关功能性药物具有重大意义。本课题旨在从泡菜和酸菜中获得具有益生功能的优质乳酸菌，为乳酸菌发酵工业、饲料及医药研发等应用提供优质的菌种以及提供良好的研究材料。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 主要材料
网购的多种泡菜水和酸菜水。
1.1.2 菌种
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Moniliaalbican）
1.1.3 主要试剂
牛肉浸膏、葡萄糖、氯化钠、磷酸氢二钾、吐温80、柠檬酸三铵、蛋白胨、无水乙酸钠、碳酸钙、七水合硫酸镁、酵母膏、一水合硫酸锰、胰蛋白胨、浓盐酸、琼脂粉、革兰氏染液、山梨酸
1.1.4主要仪器及设备
超净工作台、恒温水浴锅、恒温培养箱、电子天平、显微镜、离心机、PH计、高压蒸汽灭菌锅
1.1.5主要培养基：
MRS碳酸钙培养基；MRS液体培养基；LB培养基（见附录）
1.2实验方法
1.2.1乳酸菌的分离纯化
将泡菜水原液进行稀释，以原液、101、102、103、104、105作为稀释梯度，每一个稀释梯度设置3个平行，每一个稀释梯度取100μl涂布于MRS碳酸钙培养基，于28℃培养箱中生长3天。将呈现透明圈的单菌落划线纯化3代备用。
1.2.2 乳酸菌抑菌能力研究
将分离出的菌株接种在MRS液体培养基中，在28℃过夜培养，然后按2%转接到3ml的MRS液体培养基，加入石蜡油，使培养基中为厌氧状态，于28℃培养1天。将培养液放以10000 rpm离心10分钟，用无菌抽滤器抽滤培养液上清，并储存在无菌离心管中备用。在LB培养基中将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌各自在LB培养基中划线，于37℃下培养过夜，以活化四种指示菌。将四种指示菌的单菌落接种到3ml的LB培养基中，在37℃下180rpm摇菌过夜，按2%转接至50mlLB培养基中，于37℃180rpm摇菌直至吸光值到达0.8，将培养液稀释5倍，取2ml稀释后的培养液放入LB培养基，转动培养基，使培养液均匀散布于整个LB培养基中，吸去多余的培养液后，在培养基中合适位置分别打上三个孔并做好标记，于孔中分别加入适量LB固体培养基进行封底，等LB固体培养基凝固后，分别于三个孔中加入50ml无菌水、50m菌株上清l和100ml菌株上清，于37℃下培养12小时后，测量抑菌圈的直径并记录实验结果。
1.2.3乳酸杆菌的鉴定
1.2.3.1 乳酸杆菌的革兰氏染色
将分离出的菌株于MRS液体培养基28℃培养1天后，将适量细菌悬液涂于载玻片的中间，在左右两边分别滴上适量的无菌水，挑取枯草芽孢杆菌菌落，混匀在左边的无菌水中作为阳性对照，将大肠杆菌菌落在右边的无菌水中混匀作为阴性对照。等菌液风干后，于载玻片上滴上结晶紫溶液进行染色1分钟，用蒸馏水洗净后，再将碘液滴于载玻片进行媒染1分钟，用蒸馏水洗净后，用95%酒精滴于载玻片进行脱色2030秒，用蒸馏水洗净，在载玻片上用碱性复红进行复染12分钟，用蒸馏水洗净，待载玻片干燥后，在10×100油镜下观察菌体形态。
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摘要 1
引言
引言
乳酸菌是革兰氏阳性菌，能够利用糖类发酵产生乳酸，是一种兼性厌氧或严格厌氧型细菌[1]。乳酸菌主要包括乳酸杆菌属、链球菌属、魏斯氏菌属、双歧杆菌属和明串珠球菌属等[2]。乳酸菌的代谢类型有糖酵解途径和磷酸戊糖途径，经过糖酵解路径发酵产生乳酸，为同型乳酸发酵，而由磷酸戊糖途径进行异型乳酸发酵，产物除乳酸外，还有乙醇、冰醋酸和 CO2 等[13]。植物乳杆菌、嗜热链球菌等进行同型乳酸发酵，而双歧杆菌、肠膜明串珠菌等为异型乳酸菌[13]。
乳酸菌在代谢的过程中能够产生许多不同的有机酸和益生活性物质，不仅能够改善食品和饲料的风味及营养，而且能够促进营养物质被人体和动物体吸收[1]。同时，有机酸形成的酸性环境以及乳酸菌产生的具有抑菌或杀菌效果的细菌素能够抑制有害微生物的生长，防止食物腐坏，延长食品保鲜期[68]。除了食品和饲料等传统领域，乳酸菌在医药领域也有巨大的应用前景[45,12]。研究显示，乳酸菌具有黏附在消化道粘膜，形成屏障排斥病原菌的定殖的特性，可以抑制消化道致病菌的生长，同时，乳酸菌的生理代谢能够刺激消化道免疫反应，提高宿主的免疫能力，而其代谢物能防治感染性和功能性消化道疾病，促进肠道的蠕动，达到润肠通便的效果[45]；乳酸菌还能够降解胆盐和对动物机体有害的亚硝酸盐，从而促进胆固醇的分解代谢，降低胆固醇，维护肠道的微生态的平衡，加强机体的一些免疫功能[5]。此外，乳酸菌还具有免疫治疗等益生特性，研发乳酸菌药物也是研究热点[4]。
目前，国内对乳酸菌的研究基本上集中于乳酸菌的分离筛选和生理生化特性分析应用，主要针对乳酸菌的产酸能力、对动物的可能的益生作用以及发酵产物对产品的影响方面。此外，一些乳酸菌的全基因组也已被测序，对乳酸菌DNA序列以及功能基因的研究也越来越深入[9,13,14]。这些研究对于乳酸菌生理生化特性研究以及功能基因研究，对乳酸菌资源进行充分利用，起到了非常重要的作用。
由于乳酸菌是 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
人体和动物体内消化道的优势菌群，对人体和动物体无害，因此在食品、医疗和饲料领域有着重要的研究前景[10,11]。因此，分离筛选发酵能力优良的乳酸菌对改良发酵产品，开发相关功能性药物具有重大意义。本课题旨在从泡菜和酸菜中获得具有益生功能的优质乳酸菌，为乳酸菌发酵工业、饲料及医药研发等应用提供优质的菌种以及提供良好的研究材料。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 主要材料
网购的多种泡菜水和酸菜水。
1.1.2 菌种
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Moniliaalbican）
1.1.3 主要试剂
牛肉浸膏、葡萄糖、氯化钠、磷酸氢二钾、吐温80、柠檬酸三铵、蛋白胨、无水乙酸钠、碳酸钙、七水合硫酸镁、酵母膏、一水合硫酸锰、胰蛋白胨、浓盐酸、琼脂粉、革兰氏染液、山梨酸
1.1.4主要仪器及设备
超净工作台、恒温水浴锅、恒温培养箱、电子天平、显微镜、离心机、PH计、高压蒸汽灭菌锅
1.1.5主要培养基：
MRS碳酸钙培养基；MRS液体培养基；LB培养基（见附录）
1.2实验方法
1.2.1乳酸菌的分离纯化
将泡菜水原液进行稀释，以原液、101、102、103、104、105作为稀释梯度，每一个稀释梯度设置3个平行，每一个稀释梯度取100μl涂布于MRS碳酸钙培养基，于28℃培养箱中生长3天。将呈现透明圈的单菌落划线纯化3代备用。
1.2.2 乳酸菌抑菌能力研究
将分离出的菌株接种在MRS液体培养基中，在28℃过夜培养，然后按2%转接到3ml的MRS液体培养基，加入石蜡油，使培养基中为厌氧状态，于28℃培养1天。将培养液放以10000 rpm离心10分钟，用无菌抽滤器抽滤培养液上清，并储存在无菌离心管中备用。在LB培养基中将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌各自在LB培养基中划线，于37℃下培养过夜，以活化四种指示菌。将四种指示菌的单菌落接种到3ml的LB培养基中，在37℃下180rpm摇菌过夜，按2%转接至50mlLB培养基中，于37℃180rpm摇菌直至吸光值到达0.8，将培养液稀释5倍，取2ml稀释后的培养液放入LB培养基，转动培养基，使培养液均匀散布于整个LB培养基中，吸去多余的培养液后，在培养基中合适位置分别打上三个孔并做好标记，于孔中分别加入适量LB固体培养基进行封底，等LB固体培养基凝固后，分别于三个孔中加入50ml无菌水、50m菌株上清l和100ml菌株上清，于37℃下培养12小时后，测量抑菌圈的直径并记录实验结果。
1.2.3乳酸杆菌的鉴定
1.2.3.1 乳酸杆菌的革兰氏染色
将分离出的菌株于MRS液体培养基28℃培养1天后，将适量细菌悬液涂于载玻片的中间，在左右两边分别滴上适量的无菌水，挑取枯草芽孢杆菌菌落，混匀在左边的无菌水中作为阳性对照，将大肠杆菌菌落在右边的无菌水中混匀作为阴性对照。等菌液风干后，于载玻片上滴上结晶紫溶液进行染色1分钟，用蒸馏水洗净后，再将碘液滴于载玻片进行媒染1分钟，用蒸馏水洗净后，用95%酒精滴于载玻片进行脱色2030秒，用蒸馏水洗净，在载玻片上用碱性复红进行复染12分钟，用蒸馏水洗净，待载玻片干燥后，在10×100油镜下观察菌体形态。
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