芽孢杆菌产抗菌肽相关基因检测
芽孢杆菌产抗菌肽相关基因检测[20200614171359]
摘要：抗菌脂肽主要是通过非核糖体途径合成的低分子量代谢物质，主要由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）产生。随着分子生物学研究手段的不断进步，人们对于抗菌脂肽类物质的研究也逐渐由结构性质、抗菌活性的探索转向物质合成机理的研究。本研究主要对实验室保藏的部分菌种提取基因组，针对几种脂肽合成酶基因设计特异性引物，扩增目的基因，通过分子克隆的方法，对菌种进行克隆检测，分析其是否具有分泌多种抗菌物质能力。结果显示，部分结果与实验室发表的论文研究结果基本一致，并且发现某些菌种中可能存在一些新的脂肽合成酶相关基因，可通过进一步实验验证该菌种是否具有产生新型抗菌肽的能力。本实验希望结合调控基因的研究对细菌多种细胞行为的调控机制进行初探，这对于发现新型抗菌肽以及应用于人类和动物疾病治疗具有重要意义。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
关键字:抗菌物质；芽孢杆菌；调控基因；克隆检测
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法...2
1.1材料 2
1.1.1菌种与质粒2
1.1.1培养基及溶液配制2
1.1.3主要生化及分子生物学试剂3
1.1.4实验仪器3
1.2试验方法 3
1.2.1 保藏菌种活化......3
1.2.2 基因组的提取..3
1.2.3 抗菌物质相关基因PCR扩增..4
1.2.4 PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测6
1.2.5 PCR产物割胶回收.6
1.2.6 PCR产物与克隆载体连接6
1.2.7 E.coli DH5α感受态制备......6
1.2.8 酶连载体转化E.coli DH5α7
1.2.9 阳性转化子筛选鉴定..........7
1.2.10 质粒提取.........................7
2结果与分析7
2.1基因组DNA提取.....7
2.2抗菌物质相关基因PCR扩增....8
2.2.1 Surfactin相关基因PCR扩增.8
2.2.2 Fengycin相关基因PCR扩增..10
2.2.3 Iturin相关基因PCR扩增.......11
2.2.4 Subtilosin A相关基因PCR扩增13
2.2.5 Bacillomycin D相关基因PCR扩增..14
2.2.6 Po *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
lymyxin相关基因PCR扩增..15
2.3抗菌物质相关基因克隆......17
3讨论 23
致谢24
参考文献24
芽孢杆菌产抗菌肽相关基因检测
生命科学学院 生命基地101班 曲晓旭
引言
引言：抗菌脂肽一般是由革兰氏阳性芽孢杆菌产生的一类代谢产物[1,2,3]，是抗菌肽中的一小类。抗菌脂肽的分子是由亲水的肽链和亲油的脂肪烃链两部分组成，由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，抗菌脂肽除了具有抗菌活性之外还具有生物表面活性剂的特性[4]，而它最初被发现却是因为其较强的表面活性。
生物表面活性剂是二十世纪七十年代后期国际生物工程领域中发展起来的一个新课题。它的最早发现可以追溯到1968年，当时日本学者Arima等[5]报道了在用Bacillus subtilis IFO3039菌株培养时，在发酵液当中发现了一个具有生物活性的新化合物。随着现代生物技术的迅猛发展以及生物表面活性剂在环保、石油开采、制药、食品加工等方面的潜在应用价值的不断被发现，人们对在工业规模上用生物技术生产生物表面活性剂产生强烈的兴趣[6]。目前已经在医药[7,8] 、农业[9,10] 、食品及化妆品[11,12]、石油开采[13]和环境治理[14]等领域有重要的应用，已引起广泛的关注。目前发现的抗菌脂肽和细菌素类的抗菌活性物质主要有：通过非核糖体途径合成的低分子量的抗菌肽表面活性素(Surfactin)、芬荠素(Fengycin)、伊枯草菌素(Iturin)和杆菌霉素(Bacillomycin)、抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)、制磷脂菌素(Plipstatin)[15,16,17,18,19]等；还有通过核糖体途径合成的细菌素TasA、Subtilin、Ericin、Mersacidin、Sublancin 和Subtilosin A 等物质[19]。抗菌脂肽的产生菌主要集中在枯草芽孢杆菌的不同菌株之间[20,10]，除枯草芽孢杆菌外，淀粉液化芽孢杆菌 (B. amyloliquefaciens) [21,22]、短小芽孢杆菌(B. pumilus) [23]、地衣芽孢杆菌(B. lichemformis)[24]、蜡样芽孢杆菌(B. cereus)[25]、苏云金芽孢杆菌(B. thuringiensis)[26]、类芽孢杆菌(Paenibacillus)[27]和环状芽孢杆菌(B. circulan)[28] 等也能产生抗菌脂肽。不同种的菌株可以产生不同或相同的抗菌脂肽，同一种细菌的不同菌株也能产生几种不同的抗菌脂肽，如枯草芽孢杆菌的某些菌株只能产生Surfactin[29,30]，而有些菌株却能同时产生Surfactin、Fengycin和Iturin[31,32]或Surfactin，Bacillomycin和Plipastatin[33]。而且，即使同一种菌株产生的同一种抗菌脂肽也不是纯的单一化合物，而是由几个或许多结构类似的同系物组成[34]。
前人的一些研究已经阐述了脂肽类化合物的物理化学和生物学特性[35,36,37,38]，但是，对于脂肽类化合物表达的分子调控机制却了解甚少[39]。本实验从抗菌脂肽产生菌、抗菌肽生物合成机理入手，对抗菌肽生物合成酶编码调控基因进行检测，进而深入探索其分子调 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
控机制。
Surfactin由 srfA operon 编码合成，该操纵子包含srfAA，srfAB，srfAC，srfAD 四种基因，编码Surfactin合成酶的四个亚基。另外operon 还包括sfp 基因，在Surfactin合成中起到了重要的调控作用[40,41,42,43]。
Fengycin 的合成基因 fen operon 由 fenC，fenD，fenE，fenA，fenB 所组成，分别编码Fengycin 合成酶的5个肽单体酶：FenC（287 kDa）、FenD（290 kDa）、FenE（286 kDa）、FenA（406 kDa）和FenB（146 kDa）。Fengycin合成酶共包含10个模块，每个模块均能活化一种氨基酸。这些被活化的氨基酸再依次连接，形成脂肽链。
Iturin 家族包括多个成员，ituDABC operon 编码iturin A 合成酶[44]，其中ituD 可能具有编码脂肪酸合成有关的丙二酰辅酶A 转酰基酶的功能。ituA 能编码449 kDa 的蛋白，与脂肪酸合成酶、氨基酸转移酶和肽合成酶都具有同源性，可能与β-氨基脂肪酸形成有关。ituB 和ituC 编码分别具有4个和2个氨基酸模块的分子量为609和297 kDa 肽合成酶。
Bacillomycin D 属于Iturin 家族的成员，由bmyCBAD operon (37.2 kb)指导合成，该操纵子由4个基因组成分别是bmyD，bmyA，bmyB，bmyC，与Iturin 的编码基因具有高度同源性。
（6）1 mol/L Tris-HCl：80 mL 超纯水中溶解 12.1 g Tris-base，用浓盐酸调 pH 值至 8.0，混匀后定容至100 mL，分装，高压灭菌。
（6）1×TE缓冲液：取0.1 mL 1 mol/L Tris-HCl溶液(pH8.0)和0.2 mL 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)混合，用超纯水定容至100 mL。
srfAD-R CGCCCATCCTGCTGAAAAAGCG
摘要：抗菌脂肽主要是通过非核糖体途径合成的低分子量代谢物质，主要由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）产生。随着分子生物学研究手段的不断进步，人们对于抗菌脂肽类物质的研究也逐渐由结构性质、抗菌活性的探索转向物质合成机理的研究。本研究主要对实验室保藏的部分菌种提取基因组，针对几种脂肽合成酶基因设计特异性引物，扩增目的基因，通过分子克隆的方法，对菌种进行克隆检测，分析其是否具有分泌多种抗菌物质能力。结果显示，部分结果与实验室发表的论文研究结果基本一致，并且发现某些菌种中可能存在一些新的脂肽合成酶相关基因，可通过进一步实验验证该菌种是否具有产生新型抗菌肽的能力。本实验希望结合调控基因的研究对细菌多种细胞行为的调控机制进行初探，这对于发现新型抗菌肽以及应用于人类和动物疾病治疗具有重要意义。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
关键字:抗菌物质；芽孢杆菌；调控基因；克隆检测
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法...2
1.1材料 2
1.1.1菌种与质粒2
1.1.1培养基及溶液配制2
1.1.3主要生化及分子生物学试剂3
1.1.4实验仪器3
1.2试验方法 3
1.2.1 保藏菌种活化......3
1.2.2 基因组的提取..3
1.2.3 抗菌物质相关基因PCR扩增..4
1.2.4 PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测6
1.2.5 PCR产物割胶回收.6
1.2.6 PCR产物与克隆载体连接6
1.2.7 E.coli DH5α感受态制备......6
1.2.8 酶连载体转化E.coli DH5α7
1.2.9 阳性转化子筛选鉴定..........7
1.2.10 质粒提取.........................7
2结果与分析7
2.1基因组DNA提取.....7
2.2抗菌物质相关基因PCR扩增....8
2.2.1 Surfactin相关基因PCR扩增.8
2.2.2 Fengycin相关基因PCR扩增..10
2.2.3 Iturin相关基因PCR扩增.......11
2.2.4 Subtilosin A相关基因PCR扩增13
2.2.5 Bacillomycin D相关基因PCR扩增..14
2.2.6 Po *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
lymyxin相关基因PCR扩增..15
2.3抗菌物质相关基因克隆......17
3讨论 23
致谢24
参考文献24
芽孢杆菌产抗菌肽相关基因检测
生命科学学院 生命基地101班 曲晓旭
引言
引言：抗菌脂肽一般是由革兰氏阳性芽孢杆菌产生的一类代谢产物[1,2,3]，是抗菌肽中的一小类。抗菌脂肽的分子是由亲水的肽链和亲油的脂肪烃链两部分组成，由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，抗菌脂肽除了具有抗菌活性之外还具有生物表面活性剂的特性[4]，而它最初被发现却是因为其较强的表面活性。
生物表面活性剂是二十世纪七十年代后期国际生物工程领域中发展起来的一个新课题。它的最早发现可以追溯到1968年，当时日本学者Arima等[5]报道了在用Bacillus subtilis IFO3039菌株培养时，在发酵液当中发现了一个具有生物活性的新化合物。随着现代生物技术的迅猛发展以及生物表面活性剂在环保、石油开采、制药、食品加工等方面的潜在应用价值的不断被发现，人们对在工业规模上用生物技术生产生物表面活性剂产生强烈的兴趣[6]。目前已经在医药[7,8] 、农业[9,10] 、食品及化妆品[11,12]、石油开采[13]和环境治理[14]等领域有重要的应用，已引起广泛的关注。目前发现的抗菌脂肽和细菌素类的抗菌活性物质主要有：通过非核糖体途径合成的低分子量的抗菌肽表面活性素(Surfactin)、芬荠素(Fengycin)、伊枯草菌素(Iturin)和杆菌霉素(Bacillomycin)、抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)、制磷脂菌素(Plipstatin)[15,16,17,18,19]等；还有通过核糖体途径合成的细菌素TasA、Subtilin、Ericin、Mersacidin、Sublancin 和Subtilosin A 等物质[19]。抗菌脂肽的产生菌主要集中在枯草芽孢杆菌的不同菌株之间[20,10]，除枯草芽孢杆菌外，淀粉液化芽孢杆菌 (B. amyloliquefaciens) [21,22]、短小芽孢杆菌(B. pumilus) [23]、地衣芽孢杆菌(B. lichemformis)[24]、蜡样芽孢杆菌(B. cereus)[25]、苏云金芽孢杆菌(B. thuringiensis)[26]、类芽孢杆菌(Paenibacillus)[27]和环状芽孢杆菌(B. circulan)[28] 等也能产生抗菌脂肽。不同种的菌株可以产生不同或相同的抗菌脂肽，同一种细菌的不同菌株也能产生几种不同的抗菌脂肽，如枯草芽孢杆菌的某些菌株只能产生Surfactin[29,30]，而有些菌株却能同时产生Surfactin、Fengycin和Iturin[31,32]或Surfactin，Bacillomycin和Plipastatin[33]。而且，即使同一种菌株产生的同一种抗菌脂肽也不是纯的单一化合物，而是由几个或许多结构类似的同系物组成[34]。
前人的一些研究已经阐述了脂肽类化合物的物理化学和生物学特性[35,36,37,38]，但是，对于脂肽类化合物表达的分子调控机制却了解甚少[39]。本实验从抗菌脂肽产生菌、抗菌肽生物合成机理入手，对抗菌肽生物合成酶编码调控基因进行检测，进而深入探索其分子调 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
控机制。
Surfactin由 srfA operon 编码合成，该操纵子包含srfAA，srfAB，srfAC，srfAD 四种基因，编码Surfactin合成酶的四个亚基。另外operon 还包括sfp 基因，在Surfactin合成中起到了重要的调控作用[40,41,42,43]。
Fengycin 的合成基因 fen operon 由 fenC，fenD，fenE，fenA，fenB 所组成，分别编码Fengycin 合成酶的5个肽单体酶：FenC（287 kDa）、FenD（290 kDa）、FenE（286 kDa）、FenA（406 kDa）和FenB（146 kDa）。Fengycin合成酶共包含10个模块，每个模块均能活化一种氨基酸。这些被活化的氨基酸再依次连接，形成脂肽链。
Iturin 家族包括多个成员，ituDABC operon 编码iturin A 合成酶[44]，其中ituD 可能具有编码脂肪酸合成有关的丙二酰辅酶A 转酰基酶的功能。ituA 能编码449 kDa 的蛋白，与脂肪酸合成酶、氨基酸转移酶和肽合成酶都具有同源性，可能与β-氨基脂肪酸形成有关。ituB 和ituC 编码分别具有4个和2个氨基酸模块的分子量为609和297 kDa 肽合成酶。
Bacillomycin D 属于Iturin 家族的成员，由bmyCBAD operon (37.2 kb)指导合成，该操纵子由4个基因组成分别是bmyD，bmyA，bmyB，bmyC，与Iturin 的编码基因具有高度同源性。
（6）1 mol/L Tris-HCl：80 mL 超纯水中溶解 12.1 g Tris-base，用浓盐酸调 pH 值至 8.0，混匀后定容至100 mL，分装，高压灭菌。
（6）1×TE缓冲液：取0.1 mL 1 mol/L Tris-HCl溶液(pH8.0)和0.2 mL 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)混合，用超纯水定容至100 mL。
srfAD-R CGCCCATCCTGCTGAAAAAGCG
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/swgc/smkx/504.html
