玉米木质部转运mirna在重金属胁迫下的表达分析
：镉（Cd2+）作为几种危害极大的的重金属之一，影响了植物个体发育中的诸多生理生化进程，严重威胁着全球的粮食生产。而越来越多的研究表明，MicroRNA（miRNA）作为一种非编码RNA（ncRNA）参与了植物体中的各种生物和非生物胁迫反应过程，其中就包括重金属毒害的应答。本文就Cd2+处理下玉米木质部转运miRNA的表达情况加以探究。我们采用经典的Trizol试剂法对玉米木质部汁液进行RNA提取，发现在木质部运输液中的确存在着miRNA，而高通量测序和荧光定量结果也均表明，在用Cd2+溶液处理后，部分木质部转运miRNA的表达情况发生了明显的变化。由此我们猜想在植物体内可能存在着一种由木质部转运miRNA介导的远距离胁迫调控机制。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言3
1材料与方法3
1.1植物材料 3
1.2实验方法 3
1.2.1样品收集3
1.2.2总RNA提取3
1.2.3miRNA检测3
1.2.4排除样品污染3
1.2.5 miRNA测序3
1.2.6 miRNA表达分析4
2结果与分析5
2.1 玉米木质部汁液中含有miRNA5
2.1.1 miRNA电泳检测5
2.1.2 miRNA测序6
2.1.3 样品污染的排除7
2.2 Cd2+胁迫下玉米木质部转运miRNA的表达变化7
3讨论8
致谢8
参考文献9
玉米木质部转运miRNA在重金属胁迫下的表达分析
生命基地111 王健
引言
近年来，全球范围内非生物胁迫已经成为一种危害环境的重要因子，它严重制约着作物的生长和生产。而重金属污染就是其中极为典型的非生物胁迫之一，重金属参与了植物体发育中的诸多生理生化进程，因此该胁迫就会导致粮食产量的显著降低[1]。土壤重金属是指由于人类活动将金属加入到土壤中，致使土壤中重金属明显高于原生含量、并造成生态环境质量恶化的现象。污染土壤的重
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
金属主要包括汞（Hg）、镉（Cd）、铅（Pb）、锌（Zn）和砷(As)等生物毒性显著的元素。重金属污染物在土壤中移动性很小，不易随水淋滤，不为微生物降解，通过食物链进入人体后，潜在危害极大。植物体需要特定含量的某些重金属(例如，Cu、Co、Ni等)用来作为各种种酶进行催化反应的辅助因子，但当植物体中重金属离子含量超过其自身对重金属离子的自净作用时，将对植物代谢和生长发育产生不良影响[2]。而在这七大金属（Cd, Cr, Cu, Hg, Ni, Pb和Zn）污染中，Cd2+的危害又最为显著[3]。Cd2+在植物体中的积累，会引起一系列的毒害症状，例如植物枯萎，生长缓慢，表现在细胞分子水平上就会出现细胞坏死[4]，与蛋白质的羧基和巯基结合而影响其活性，导致活性氧的产生[5]。因此植物Cd2+毒害耐受的分子机制已经成为当今世界的一大热门探究领域。近几年，相关工作取得了一些进步，部分作物中的镉胁迫反应的转运蛋白和信号分子陆续被发现。其中，miRNA作为一种非编码RNA，也被报道参与到了镉胁迫反应中，它可以靶向作用到与胁迫反应中转运、信号和螯合固定相关的转录本[6]。例如，miR156就可以作用到γ谷氨酰转移酶(GGT)，而后者则能和植物螯合肽合成酶一起在植物螯合肽和三聚谷胱甘肽存在的情况下与相应的重金属螯合并将其转运到液泡中，从而起到解除重金属毒害的作用[7]。在高等植物中，miR164能与单巯基谷氧还蛋白作用而调节Cd2+引起的氧化胁迫[8]等等。诸多的这些结果都表明了在镉胁迫中可能存在着一种miRNA参与的的调节机制[6]。
miRNA是指大小在22nt左右的具有调控功能的一类非编码小分子RNA[9]，最初是在研究线虫（C. elegans）发育时相基因时发现的[10, 11]，近年来已经成为一个热门研究领域。到目前为止，在植物中已有至少涉及150个家族数百个miRNA被发现和报导。与动物中的miRNA不同，转录植物miRNA的基因非成簇存在，而且是位于两个基因间的区域[12]。在加工形成过程中，植物miRNA主要经历以下几个过程。首先，miRNA基因被RNA聚合酶Ⅱ等转录成初级miRNA（primiRNA），然后primiRNA与DDL、SE和HYL1蛋白结合后被DCL1加工成双链miRNA（miRNA duplex）。紧接着其3’端被HEN1甲基化，并被HASTY从细胞核转运到细胞质，最后其中的一条链与AGO1结合，装载形成RISC复合体[13]。依赖与靶序列的同源性，RISC复合体中的miRNA与靶序列互补结合，然后再由AGO1将特异性的位点切除或者抑制翻译[14]。miRNA普遍参与了许多植物细胞活动中的基因表达调控。因此，目前也有人提出，在植物体中存在着一种由miRNA参与形成的网络机制，它在植物的发育过程中对各种基因起到了时空调控作用[13]。大多数miRNA调节的是编码与植物发育相关的转录因子或调节蛋白的基因，例如，miR393和miR160通过调节生长素信号通路中生长素受体和效应蛋白基因的表达而实现植物体中生长素含量的平衡[15]。尽管miRNA更多地涉及到的是植物的个体发育过程，但随着研究的逐渐增多，我们发现miRNA也可能参与到了一系列的胁迫反应中，其中包括温度胁迫、渗透胁迫以及细菌或病毒侵染后的中和反应等[13]。近年来研究表明miRNA在植物对重金属胁迫的响应过程中发挥重要作用，在重金属胁迫下, 植物miRNA表达量发生显著上调或下调, 以响应重金属胁迫[16]。例如，实时荧光定量PCR表明，在用80μM的Cd2+处理后，蒺藜苜蓿中的miR171、miR319、miR393和miR529表达出现上调，而miR166和miR398的表达量则下调[17]。
信号转导对于细胞内各个细胞器协调工作起着至关重要的作用，但是对于植物体这种多细胞的高等生物来说，仅仅只靠细胞内的信号分子来控制其生长发育显然是不够的，因此一种关于能够协调植物整体系统发育的远距离调控机制的研究进入了大家的视野[18]。维管束是一种由木质部和韧皮部组成的输导组织，传统意义上，我们认为木质部的导管主要将根吸收的水和无机盐等运输供给到植物体的地上部位，而韧皮部筛管则是把叶片通过光合作用生成的有机物例如氨基酸和糖分等，由源运送到库以供给自身的生长发育。近几年的研究发现，维管组织中可能蕴含着植物体的一种远距离调控机制，已有文章指出在维管运输液中发现了可以作为信号分子的蛋白质等物质并且可以起到应答外界环境胁迫的作用[19]。其中，有关韧皮部运输液中的miRNA和蛋白质在远距离信号转导中的发现和生物学功能已得到了很好地阐述[18, 20]。但是，对于木质部汁液中的多肽、miRNA和蛋白质的功能意义我们还知之甚少[21]。因此，要揭开木质部在植物体中扮演着何种复杂的角色这一谜底，我们还需要进一步的研究。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言3
1材料与方法3
1.1植物材料 3
1.2实验方法 3
1.2.1样品收集3
1.2.2总RNA提取3
1.2.3miRNA检测3
1.2.4排除样品污染3
1.2.5 miRNA测序3
1.2.6 miRNA表达分析4
2结果与分析5
2.1 玉米木质部汁液中含有miRNA5
2.1.1 miRNA电泳检测5
2.1.2 miRNA测序6
2.1.3 样品污染的排除7
2.2 Cd2+胁迫下玉米木质部转运miRNA的表达变化7
3讨论8
致谢8
参考文献9
玉米木质部转运miRNA在重金属胁迫下的表达分析
生命基地111 王健
引言
近年来，全球范围内非生物胁迫已经成为一种危害环境的重要因子，它严重制约着作物的生长和生产。而重金属污染就是其中极为典型的非生物胁迫之一，重金属参与了植物体发育中的诸多生理生化进程，因此该胁迫就会导致粮食产量的显著降低[1]。土壤重金属是指由于人类活动将金属加入到土壤中，致使土壤中重金属明显高于原生含量、并造成生态环境质量恶化的现象。污染土壤的重
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
金属主要包括汞（Hg）、镉（Cd）、铅（Pb）、锌（Zn）和砷(As)等生物毒性显著的元素。重金属污染物在土壤中移动性很小，不易随水淋滤，不为微生物降解，通过食物链进入人体后，潜在危害极大。植物体需要特定含量的某些重金属(例如，Cu、Co、Ni等)用来作为各种种酶进行催化反应的辅助因子，但当植物体中重金属离子含量超过其自身对重金属离子的自净作用时，将对植物代谢和生长发育产生不良影响[2]。而在这七大金属（Cd, Cr, Cu, Hg, Ni, Pb和Zn）污染中，Cd2+的危害又最为显著[3]。Cd2+在植物体中的积累，会引起一系列的毒害症状，例如植物枯萎，生长缓慢，表现在细胞分子水平上就会出现细胞坏死[4]，与蛋白质的羧基和巯基结合而影响其活性，导致活性氧的产生[5]。因此植物Cd2+毒害耐受的分子机制已经成为当今世界的一大热门探究领域。近几年，相关工作取得了一些进步，部分作物中的镉胁迫反应的转运蛋白和信号分子陆续被发现。其中，miRNA作为一种非编码RNA，也被报道参与到了镉胁迫反应中，它可以靶向作用到与胁迫反应中转运、信号和螯合固定相关的转录本[6]。例如，miR156就可以作用到γ谷氨酰转移酶(GGT)，而后者则能和植物螯合肽合成酶一起在植物螯合肽和三聚谷胱甘肽存在的情况下与相应的重金属螯合并将其转运到液泡中，从而起到解除重金属毒害的作用[7]。在高等植物中，miR164能与单巯基谷氧还蛋白作用而调节Cd2+引起的氧化胁迫[8]等等。诸多的这些结果都表明了在镉胁迫中可能存在着一种miRNA参与的的调节机制[6]。
miRNA是指大小在22nt左右的具有调控功能的一类非编码小分子RNA[9]，最初是在研究线虫（C. elegans）发育时相基因时发现的[10, 11]，近年来已经成为一个热门研究领域。到目前为止，在植物中已有至少涉及150个家族数百个miRNA被发现和报导。与动物中的miRNA不同，转录植物miRNA的基因非成簇存在，而且是位于两个基因间的区域[12]。在加工形成过程中，植物miRNA主要经历以下几个过程。首先，miRNA基因被RNA聚合酶Ⅱ等转录成初级miRNA（primiRNA），然后primiRNA与DDL、SE和HYL1蛋白结合后被DCL1加工成双链miRNA（miRNA duplex）。紧接着其3’端被HEN1甲基化，并被HASTY从细胞核转运到细胞质，最后其中的一条链与AGO1结合，装载形成RISC复合体[13]。依赖与靶序列的同源性，RISC复合体中的miRNA与靶序列互补结合，然后再由AGO1将特异性的位点切除或者抑制翻译[14]。miRNA普遍参与了许多植物细胞活动中的基因表达调控。因此，目前也有人提出，在植物体中存在着一种由miRNA参与形成的网络机制，它在植物的发育过程中对各种基因起到了时空调控作用[13]。大多数miRNA调节的是编码与植物发育相关的转录因子或调节蛋白的基因，例如，miR393和miR160通过调节生长素信号通路中生长素受体和效应蛋白基因的表达而实现植物体中生长素含量的平衡[15]。尽管miRNA更多地涉及到的是植物的个体发育过程，但随着研究的逐渐增多，我们发现miRNA也可能参与到了一系列的胁迫反应中，其中包括温度胁迫、渗透胁迫以及细菌或病毒侵染后的中和反应等[13]。近年来研究表明miRNA在植物对重金属胁迫的响应过程中发挥重要作用，在重金属胁迫下, 植物miRNA表达量发生显著上调或下调, 以响应重金属胁迫[16]。例如，实时荧光定量PCR表明，在用80μM的Cd2+处理后，蒺藜苜蓿中的miR171、miR319、miR393和miR529表达出现上调，而miR166和miR398的表达量则下调[17]。
信号转导对于细胞内各个细胞器协调工作起着至关重要的作用，但是对于植物体这种多细胞的高等生物来说，仅仅只靠细胞内的信号分子来控制其生长发育显然是不够的，因此一种关于能够协调植物整体系统发育的远距离调控机制的研究进入了大家的视野[18]。维管束是一种由木质部和韧皮部组成的输导组织，传统意义上，我们认为木质部的导管主要将根吸收的水和无机盐等运输供给到植物体的地上部位，而韧皮部筛管则是把叶片通过光合作用生成的有机物例如氨基酸和糖分等，由源运送到库以供给自身的生长发育。近几年的研究发现，维管组织中可能蕴含着植物体的一种远距离调控机制，已有文章指出在维管运输液中发现了可以作为信号分子的蛋白质等物质并且可以起到应答外界环境胁迫的作用[19]。其中，有关韧皮部运输液中的miRNA和蛋白质在远距离信号转导中的发现和生物学功能已得到了很好地阐述[18, 20]。但是，对于木质部汁液中的多肽、miRNA和蛋白质的功能意义我们还知之甚少[21]。因此，要揭开木质部在植物体中扮演着何种复杂的角色这一谜底，我们还需要进一步的研究。
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