番茄黄化曲叶病毒基因组潜在开放阅读框的番茄黄化曲叶病毒基因组潜在开放阅读框的鉴定与功能验证(附件)【字数：9432】
番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV）是一种在世界范围内对作物生产造成严重威胁的双生病毒。TYLCV的基因组全长约2.8 kb，编码CP、V2、Rep、C2、C3、C4六个病毒蛋白。这些蛋白在TYLCV的侵染和抑制植物免疫反应中起到了重要的作用。但是在TYLCV基因组中，还存在着可能编码小于10 kd的潜在开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）。这些ORF在植物与双生病毒互作中是否有功能目前还是未知的。在实验室前期生物信息分析数据的基础上，我们在TYLCV基因组中筛选了5个潜在的ORF—ORF37、ORF12、ORF15、ORF2、ORF3，并用结构预测软件对这些ORF的跨膜结构域和信号肽序列进行预测。我们克隆了这些潜在ORF的片段，并且构建了这些ORF的入门载体和表达载体。将这些表达载体导入到农杆菌中并将菌液注射本氏烟草瞬时表达并且用激光共聚焦显微镜观察这些ORF的亚细胞定位信号。我们发现ORF37类似于GFP空载信号，ORF2与ORF12定位在内质网中，ORF12还可能定位在胞外空间。ORF3和ORF15定位在高尔基体中。总之，我们的实验说明了TYLCV中编码产物小于10 kd的ORF有可能在植物-病毒互作中起到重要作用。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1材料与方法4
1.1实验材料 4
1.2实验方法 4
1.2.1 TYLCV基因组潜在ORF的筛选及其引物设计4
1.2.2 候选ORF片段入门载体的构建5
1.2.3候选ORF片段表达载体的构建5
1.2.4大肠杆菌Trans T1商业感受态细胞的热激转化6
1.2.5 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的热激转化6
1.2.6农杆菌注射本氏烟叶片瞬时表达6
1.2.7六个ORF潜在编码产物的跨膜结构域预测与信号肽预测6
1.2.8 激光共聚焦显微镜观察本氏烟叶片中的荧光信号7
2 结果与分析7
2.1六个候选ORF入门载体与表达载体的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
构建7
2.2六个候选ORF潜在编码产物的结构预测7
2.3候选ORF表达产物的亚细胞定位分析9
2.3.1 ORF2表达产物的亚细胞定位分析9
2.3.2 ORF3与ORF15表达产物的亚细胞定位分析10
2.3.3 ORF12表达产物的亚细胞定位分析11
2.3.4 ORF37表达产物的亚细胞定位分析12
3 讨论13
3.1 实验结果分析讨论13
3.2 未来工作计划14
致谢15
参考文献16
附录17
番茄黄化曲叶病毒基因组潜在开放阅读框的鉴定与功能验证
生命基地152班 戎俊杰
引言
引言
番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV）属于双生病毒科菜豆金色花叶病毒属，能够侵染番茄、烟草等经济作物，每年对世界范围内的农业生产造成巨大的损失[1]。自2006年在上海发现侵染番茄的TYLCV后，该病毒病以迅猛的态势在国内流行，目前已经成为国内蔬菜作物中检出率第12高的病毒，严重威胁国内经济作物的生产安全[2, 3]。
TYLCV的基因组为一条单链环状DNA（ssDNA），全长2.7 kb，侵染性克隆为3.4 kb。在其正义链上目前已经鉴定到2个开放阅读框（Open Reading Frame, ORF），分别编码一个CP蛋白和V2蛋白。CP是构成双生病毒粒体的唯一蛋白，也是双生病毒在介体传毒过程中其作用的唯一蛋白[4]。V2是TYLCV编码的基因沉默抑制子，能够分别抑制植物的转录后基因沉默[5]与转录水平的基因沉默[6,7]。其互补链上鉴定到4个ORF，分别编码一个Rep蛋白、C2蛋白、C3蛋白和C4蛋白。Rep是TYLCV的复制蛋白。C2蛋白是重要的转录调控因子，并且能够参与抑制植物的生长代谢通路[8,9]。C3是复制增强蛋白，调控病毒DNA的聚集[10]。C4蛋白是TYLCV的重要致病决定因子，能够抑制植物RNA干扰的细胞间传递[11]。这些蛋白在TYLCV自身复制和侵染破坏植物免疫系统的过程中起到重要的作用[4]。因此，TYLCV病毒蛋白的攻击靶标以及致病机理成为了植物与双生病毒互作研究的重点。
目前，学界对双生病毒蛋白的研究聚焦于分子量大于10 kDa的蛋白（其ORF大于10 kDa），对于基因组中编码产物低于10 kDa的ORF研究较少。目前已经有研究表明，在印度绿豆黄花叶病毒（Mungbean yellow mosaic India virus, MVMIV）基因组互补链上存在一个编码产物小于10 kDa的ORF编码AC5蛋白，该蛋白能够抑制寄主的转录基因沉默和转录后基因沉默，并且能够激发寄主的过敏反应[12]。虽然同为双生病毒科病毒，在TYLCV中还没有发现类似的ORF，另外，是否还存在其他编码蛋白小于10 kDa的ORF还是一个未知数。我们通过对TYLCVAlmeria（NCBI编号：AJ489258.1）基因组中潜在ORF编码产物进行结构分析预测，并构建这些ORF的GFP与RFP融合表达载体，转化根癌农杆菌GV3101并浸润本氏烟草叶片进行瞬时表达，在激光共聚焦显微镜下观察这些ORF潜在的亚细胞表达定位。
1. 材料与方法
1.1. 实验材料
植物材料：由本实验室保存的野生型本氏烟草（Nicotiana benthamiana）、由本实验室保存的野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana）哥伦比亚Col0株
病毒材料：由本实验室构建并保存的TYLCVAlmeria基因组克隆（连接于pENTRTOPO载体）[13]
细菌材料：从Trans公司采购得到的大肠杆菌Trans T1/DH5α株、由实验室自行制备的根癌农杆菌GV3101热激感受态细胞。
1.2. 实验方法
1.2.1. TYLCV基因组潜在ORF的筛选及其引物设计
利用NCBI数据库的Open Reading Frame Finder模块功能（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/），以TYLCVisolate Almeria（NCBI编号：AJ489258.1）的全长基因组序列为模板，筛选出所有潜在的，大于30 nt的ORF，并根据本实验室前期的生物信息学分析数据，挑选出在TYLCV种内保守程度较高的七个ORF——ORF37（C5），ORF30（C6），ORF42，ORF12，ORF15，ORF2和ORF3作为候选ORF，并获得其核苷酸序列，构建全新的TYLCV基因组图谱（图1.1）。之后根据其中六个ORF序列（ORF37、ORF42、ORF12、ORF15、ORF2、ORF3）分别设计出各自的正向引物，和含有终止密码子（S）以及不含有终止密码子（NS）的反向引物，用于后续的PCR反应（见附录A）。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1材料与方法4
1.1实验材料 4
1.2实验方法 4
1.2.1 TYLCV基因组潜在ORF的筛选及其引物设计4
1.2.2 候选ORF片段入门载体的构建5
1.2.3候选ORF片段表达载体的构建5
1.2.4大肠杆菌Trans T1商业感受态细胞的热激转化6
1.2.5 根癌农杆菌GV3101感受态细胞的热激转化6
1.2.6农杆菌注射本氏烟叶片瞬时表达6
1.2.7六个ORF潜在编码产物的跨膜结构域预测与信号肽预测6
1.2.8 激光共聚焦显微镜观察本氏烟叶片中的荧光信号7
2 结果与分析7
2.1六个候选ORF入门载体与表达载体的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
构建7
2.2六个候选ORF潜在编码产物的结构预测7
2.3候选ORF表达产物的亚细胞定位分析9
2.3.1 ORF2表达产物的亚细胞定位分析9
2.3.2 ORF3与ORF15表达产物的亚细胞定位分析10
2.3.3 ORF12表达产物的亚细胞定位分析11
2.3.4 ORF37表达产物的亚细胞定位分析12
3 讨论13
3.1 实验结果分析讨论13
3.2 未来工作计划14
致谢15
参考文献16
附录17
番茄黄化曲叶病毒基因组潜在开放阅读框的鉴定与功能验证
生命基地152班 戎俊杰
引言
引言
番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV）属于双生病毒科菜豆金色花叶病毒属，能够侵染番茄、烟草等经济作物，每年对世界范围内的农业生产造成巨大的损失[1]。自2006年在上海发现侵染番茄的TYLCV后，该病毒病以迅猛的态势在国内流行，目前已经成为国内蔬菜作物中检出率第12高的病毒，严重威胁国内经济作物的生产安全[2, 3]。
TYLCV的基因组为一条单链环状DNA（ssDNA），全长2.7 kb，侵染性克隆为3.4 kb。在其正义链上目前已经鉴定到2个开放阅读框（Open Reading Frame, ORF），分别编码一个CP蛋白和V2蛋白。CP是构成双生病毒粒体的唯一蛋白，也是双生病毒在介体传毒过程中其作用的唯一蛋白[4]。V2是TYLCV编码的基因沉默抑制子，能够分别抑制植物的转录后基因沉默[5]与转录水平的基因沉默[6,7]。其互补链上鉴定到4个ORF，分别编码一个Rep蛋白、C2蛋白、C3蛋白和C4蛋白。Rep是TYLCV的复制蛋白。C2蛋白是重要的转录调控因子，并且能够参与抑制植物的生长代谢通路[8,9]。C3是复制增强蛋白，调控病毒DNA的聚集[10]。C4蛋白是TYLCV的重要致病决定因子，能够抑制植物RNA干扰的细胞间传递[11]。这些蛋白在TYLCV自身复制和侵染破坏植物免疫系统的过程中起到重要的作用[4]。因此，TYLCV病毒蛋白的攻击靶标以及致病机理成为了植物与双生病毒互作研究的重点。
目前，学界对双生病毒蛋白的研究聚焦于分子量大于10 kDa的蛋白（其ORF大于10 kDa），对于基因组中编码产物低于10 kDa的ORF研究较少。目前已经有研究表明，在印度绿豆黄花叶病毒（Mungbean yellow mosaic India virus, MVMIV）基因组互补链上存在一个编码产物小于10 kDa的ORF编码AC5蛋白，该蛋白能够抑制寄主的转录基因沉默和转录后基因沉默，并且能够激发寄主的过敏反应[12]。虽然同为双生病毒科病毒，在TYLCV中还没有发现类似的ORF，另外，是否还存在其他编码蛋白小于10 kDa的ORF还是一个未知数。我们通过对TYLCVAlmeria（NCBI编号：AJ489258.1）基因组中潜在ORF编码产物进行结构分析预测，并构建这些ORF的GFP与RFP融合表达载体，转化根癌农杆菌GV3101并浸润本氏烟草叶片进行瞬时表达，在激光共聚焦显微镜下观察这些ORF潜在的亚细胞表达定位。
1. 材料与方法
1.1. 实验材料
植物材料：由本实验室保存的野生型本氏烟草（Nicotiana benthamiana）、由本实验室保存的野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana）哥伦比亚Col0株
病毒材料：由本实验室构建并保存的TYLCVAlmeria基因组克隆（连接于pENTRTOPO载体）[13]
细菌材料：从Trans公司采购得到的大肠杆菌Trans T1/DH5α株、由实验室自行制备的根癌农杆菌GV3101热激感受态细胞。
1.2. 实验方法
1.2.1. TYLCV基因组潜在ORF的筛选及其引物设计
利用NCBI数据库的Open Reading Frame Finder模块功能（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/），以TYLCVisolate Almeria（NCBI编号：AJ489258.1）的全长基因组序列为模板，筛选出所有潜在的，大于30 nt的ORF，并根据本实验室前期的生物信息学分析数据，挑选出在TYLCV种内保守程度较高的七个ORF——ORF37（C5），ORF30（C6），ORF42，ORF12，ORF15，ORF2和ORF3作为候选ORF，并获得其核苷酸序列，构建全新的TYLCV基因组图谱（图1.1）。之后根据其中六个ORF序列（ORF37、ORF42、ORF12、ORF15、ORF2、ORF3）分别设计出各自的正向引物，和含有终止密码子（S）以及不含有终止密码子（NS）的反向引物，用于后续的PCR反应（见附录A）。
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