转录因子ap1调控灵芝胞内钙离子含量的研究
：灵芝是著名的大型药用真菌，具有极高的营养价值和药用价值。灵芝三萜类化合物是灵芝的主要药用成分之一，具有抗氧化、抗病毒、降血压和抗肿瘤等活性。动植物中，ROS被报道能够与钙信号通路进行互作，激活钙通道，增加钙离子向胞内的流入进而影响钙信号传递。其中，钙离子作为生物体内重要的第二信使参与多种生物学功能，但是此类信号调控机制在真菌中鲜有报道。本课题主要研究转录因子AP1通过ROS调控Ca2+含量对灵芝三萜含量的影响，一方面通过氧化胁迫提高三萜含量来探究在此过程中AP1的表达量是否有所提高。另一方面通过对AP1的基因沉默和过量表达来探究AP1对于灵芝的抗氧胁迫、抗渗透压产生的影响，进一步探讨转录因子AP1对灵芝三萜含量的影响。
目录
引言 4
1 材料与方法 5
1.1 材料 5
1.2 方法 6
2 结果与分析 7
2.1 灵芝AP1的进化分析结果 7
2.2 荧光定量PCR检测氧化还原系统相关基因 8
2.3 氧化胁迫对转录因子AP1的影响 8
2.4 氧化胁迫对转化子的生长影响 9
2.5 氧化胁迫对灵芝菌丝分叉的影响 9
2.6 荧光检测钙离子含量 10
2.7 H2O2和NAC对灵芝胞内钙离子含量的影响....................11
讨论.............................................................12
致谢 12
参考文献 13
转录因子AP1调控灵芝胞内钙离子含量的研究
生物科学 蒋倩
引言
灵芝是一种大型真菌，属担子菌纲、多孔菌科、灵芝属（Ganoderma）[1]，是我国的一种传统的名贵药材，在民间有悠久而广泛的应用，中医学认为它起滋补强壮、扶正固本的作用[2]。灵芝对人类健康的作用也日益受到国际上的重视，进一步开发灵芝的药用价值是当今药用菌研究的一个热点和前沿。三萜类化合物作为灵芝的主要药用成分之一，具有镇静、抗氧化、抗病毒、降血
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
压和抗肿瘤等活性，其含量的高低是目前衡量灵芝质量的重要指标，三萜类物质是灵芝的次级代谢产物，通过甲羟戊酸途径合成[3]。通过研究对灵芝三萜合成起调控作用的基因，了解其机理，对提高灵芝药用成分含量无疑将大有帮助。
转录因子(Transcription factor, TF)又称反式作用因子, 是指能与真核基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性结合, 通过它们之间以及与其他相关蛋白之间的相互作用, 激活或抑制转录, 从而保证目的基因以特定的强度、在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。Activating protein1(AP1)是一类转录因子，它的家族中包括Jun、Fos以及ATF等bZIP蛋白，AP1作为转录因子，与其他转录因子相同，都是通过结合目的基因启动子区域的特定位点来完成激活或抑制基因表达的目的[4]。在其他物种中，它担任着调控细胞抗氧化、调控次生代谢作用[5]，我们推测在灵芝生长中，AP1也同样担任着相同或相似作用。
ROS（Reactive Oxygen Species）指的是活性氧物质，主要包括：超氧阴离子（O2?）、单线态氧（O21）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（OH?）等，这些细胞新陈代谢的副产物对动、植物是有毒性的。NADPH氧化酶基因功能的发现，低浓度ROS也可以作为信号分子在许多动物、植物生理活动中参与重要的作用，如直接杀伤病原物、强化细胞壁、诱导植保素合成、诱导超敏反应（HR）、参与细胞程序性死亡、诱导防卫基因的表达等过程[6]。
钙离子是钙元素在化合物中的存在形式。Ca2+参与的信号转导一方面依靠浓度的振荡传递信号，另一方面依靠其下游的功能蛋白放大信号。它对于维持细胞膜两侧的钙离子碱性还原棒生物电位，维持正常的神经传导功能。维持正常的肌肉伸缩与舒张功能以及神经－肌肉传导功能[7]。钙离子对植物的形态及生理有重要功能。能维持细胞壁、细胞膜及膜结合蛋白的稳定性，参与胞内稳态和生长发育过程，在细胞内起第二信使的作用。对环境信号和内源激素信号等许多刺激有灵敏反应，病原物侵染、植物激素、逆境均能引起植物体内Ca2+含量变化[8]。
本课题主要研究转录因子AP1通过ROS调控Ca2+含量对灵芝三萜含量的影响。比较AP1转化菌株与野生型菌株WT之间Ca2+浓度差异以及由此导致的灵芝生长和次生代谢的差异，进一步探讨转录因子AP1对灵芝三萜含量的影响。一方面通过添加氧化剂和抗氧化剂研究ROS对Ca2+的影响来探究AP1转化子中这两种信号分子的相互影响，另一方面通过添加Ca2+（Cacl2等）和抑制剂（EGTA等）来研究转化子AP1与野生型菌株中因为Ca2+含量差异而导致的生长和次生代谢差异。进而通过调控转录因子AP1提高灵芝三萜含量，提高灵芝的药用价值。
材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株、质粒、试剂 灵芝（Ganoderma lucidum G20）保存于实验室，构建AP1沉默菌株，大肠杆菌DH5α，pMD18T vector、pAN7dual vector、Taq DNA polymerase、限制酶、T4 DNA ligase购自大连Takara公司。所用到的抗生素均购自上海生工生物工程公司，ROS检测试剂NBT（sigma）、荧光染料DCHFDA（sigma）、NADPH氧化酶抑制剂DPI（Sigma），Ca2+荧光探针Fluo3AM（Sigma），其它试剂均为分析纯。
1.1.2培养基 PDA培养基、CYM培养基
CYM培养基：蛋白胨2g、酵母膏2g、葡萄糖20g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾0.46g、磷酸氢二钾1.0g、蒸馏水加至10001ml
PDA培养基：马铃薯汁1000ml、葡萄糖20g、琼脂20g
1.1.3主要仪器和设备 28 ℃恒温培养箱、烘箱、分析天平、天平、小型种子打碎机、摇床、超声波清洗仪、无菌超净台、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅、722可见分光光度计、激光共聚焦显微镜、荧光定量PCR仪等。
1.1.4菌株培养 灵芝菌株在CYM液体培养基中，150 r/min， 28 °C培养6天，斜面菌株4 °C保存。大肠杆菌DH5α在LB培养基上37 °C培养，菌株在含有25%甘油的LB培养基中70 °C保存。
1.2方法
1.2.1碱裂解法提取质粒
吸取1.0ml菌液于1.5 ml离心管中，离心，弃上清，吸干。加SolutionⅠ100 μL，枪吸打，菌体悬浮裂解。加SolutionⅡ200 μL，混匀后冰浴。加SolutionⅢ150 μL，温和振荡，20℃放置10 min，使细胞壁蛋白质沉淀，离心后转移上清。加两倍体积预冷的无水乙醇混匀数次，室温放置。再离心弃上清，吸干，加200 μl 70%乙醇，离心后弃上清。最后吸干，37℃晾干10 min，加30 μl ddH2O和1 μLRNase，37 ℃溶解30 min，20 ℃备用。
1.2.2载体的酶切酶连
目录
引言 4
1 材料与方法 5
1.1 材料 5
1.2 方法 6
2 结果与分析 7
2.1 灵芝AP1的进化分析结果 7
2.2 荧光定量PCR检测氧化还原系统相关基因 8
2.3 氧化胁迫对转录因子AP1的影响 8
2.4 氧化胁迫对转化子的生长影响 9
2.5 氧化胁迫对灵芝菌丝分叉的影响 9
2.6 荧光检测钙离子含量 10
2.7 H2O2和NAC对灵芝胞内钙离子含量的影响....................11
讨论.............................................................12
致谢 12
参考文献 13
转录因子AP1调控灵芝胞内钙离子含量的研究
生物科学 蒋倩
引言
灵芝是一种大型真菌，属担子菌纲、多孔菌科、灵芝属（Ganoderma）[1]，是我国的一种传统的名贵药材，在民间有悠久而广泛的应用，中医学认为它起滋补强壮、扶正固本的作用[2]。灵芝对人类健康的作用也日益受到国际上的重视，进一步开发灵芝的药用价值是当今药用菌研究的一个热点和前沿。三萜类化合物作为灵芝的主要药用成分之一，具有镇静、抗氧化、抗病毒、降血
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
压和抗肿瘤等活性，其含量的高低是目前衡量灵芝质量的重要指标，三萜类物质是灵芝的次级代谢产物，通过甲羟戊酸途径合成[3]。通过研究对灵芝三萜合成起调控作用的基因，了解其机理，对提高灵芝药用成分含量无疑将大有帮助。
转录因子(Transcription factor, TF)又称反式作用因子, 是指能与真核基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性结合, 通过它们之间以及与其他相关蛋白之间的相互作用, 激活或抑制转录, 从而保证目的基因以特定的强度、在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。Activating protein1(AP1)是一类转录因子，它的家族中包括Jun、Fos以及ATF等bZIP蛋白，AP1作为转录因子，与其他转录因子相同，都是通过结合目的基因启动子区域的特定位点来完成激活或抑制基因表达的目的[4]。在其他物种中，它担任着调控细胞抗氧化、调控次生代谢作用[5]，我们推测在灵芝生长中，AP1也同样担任着相同或相似作用。
ROS（Reactive Oxygen Species）指的是活性氧物质，主要包括：超氧阴离子（O2?）、单线态氧（O21）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（OH?）等，这些细胞新陈代谢的副产物对动、植物是有毒性的。NADPH氧化酶基因功能的发现，低浓度ROS也可以作为信号分子在许多动物、植物生理活动中参与重要的作用，如直接杀伤病原物、强化细胞壁、诱导植保素合成、诱导超敏反应（HR）、参与细胞程序性死亡、诱导防卫基因的表达等过程[6]。
钙离子是钙元素在化合物中的存在形式。Ca2+参与的信号转导一方面依靠浓度的振荡传递信号，另一方面依靠其下游的功能蛋白放大信号。它对于维持细胞膜两侧的钙离子碱性还原棒生物电位，维持正常的神经传导功能。维持正常的肌肉伸缩与舒张功能以及神经－肌肉传导功能[7]。钙离子对植物的形态及生理有重要功能。能维持细胞壁、细胞膜及膜结合蛋白的稳定性，参与胞内稳态和生长发育过程，在细胞内起第二信使的作用。对环境信号和内源激素信号等许多刺激有灵敏反应，病原物侵染、植物激素、逆境均能引起植物体内Ca2+含量变化[8]。
本课题主要研究转录因子AP1通过ROS调控Ca2+含量对灵芝三萜含量的影响。比较AP1转化菌株与野生型菌株WT之间Ca2+浓度差异以及由此导致的灵芝生长和次生代谢的差异，进一步探讨转录因子AP1对灵芝三萜含量的影响。一方面通过添加氧化剂和抗氧化剂研究ROS对Ca2+的影响来探究AP1转化子中这两种信号分子的相互影响，另一方面通过添加Ca2+（Cacl2等）和抑制剂（EGTA等）来研究转化子AP1与野生型菌株中因为Ca2+含量差异而导致的生长和次生代谢差异。进而通过调控转录因子AP1提高灵芝三萜含量，提高灵芝的药用价值。
材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株、质粒、试剂 灵芝（Ganoderma lucidum G20）保存于实验室，构建AP1沉默菌株，大肠杆菌DH5α，pMD18T vector、pAN7dual vector、Taq DNA polymerase、限制酶、T4 DNA ligase购自大连Takara公司。所用到的抗生素均购自上海生工生物工程公司，ROS检测试剂NBT（sigma）、荧光染料DCHFDA（sigma）、NADPH氧化酶抑制剂DPI（Sigma），Ca2+荧光探针Fluo3AM（Sigma），其它试剂均为分析纯。
1.1.2培养基 PDA培养基、CYM培养基
CYM培养基：蛋白胨2g、酵母膏2g、葡萄糖20g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾0.46g、磷酸氢二钾1.0g、蒸馏水加至10001ml
PDA培养基：马铃薯汁1000ml、葡萄糖20g、琼脂20g
1.1.3主要仪器和设备 28 ℃恒温培养箱、烘箱、分析天平、天平、小型种子打碎机、摇床、超声波清洗仪、无菌超净台、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅、722可见分光光度计、激光共聚焦显微镜、荧光定量PCR仪等。
1.1.4菌株培养 灵芝菌株在CYM液体培养基中，150 r/min， 28 °C培养6天，斜面菌株4 °C保存。大肠杆菌DH5α在LB培养基上37 °C培养，菌株在含有25%甘油的LB培养基中70 °C保存。
1.2方法
1.2.1碱裂解法提取质粒
吸取1.0ml菌液于1.5 ml离心管中，离心，弃上清，吸干。加SolutionⅠ100 μL，枪吸打，菌体悬浮裂解。加SolutionⅡ200 μL，混匀后冰浴。加SolutionⅢ150 μL，温和振荡，20℃放置10 min，使细胞壁蛋白质沉淀，离心后转移上清。加两倍体积预冷的无水乙醇混匀数次，室温放置。再离心弃上清，吸干，加200 μl 70%乙醇，离心后弃上清。最后吸干，37℃晾干10 min，加30 μl ddH2O和1 μLRNase，37 ℃溶解30 min，20 ℃备用。
1.2.2载体的酶切酶连
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