崇明拟异小杆线虫不同单菌组合的mirnas差异表达研究
：昆虫病原线虫是一种携有引起昆虫致病的共生菌的昆虫寄生性线虫，作为非常有潜力的生物防治因子，其具有宿主范围广，对人畜安全及环境安全等优点。miRNA是一类内源性的小分子RNA，能够在转录后水平参与抑制mRNA的表达。本研究中，选取5个差异表达的miRNAs (miR-2214，miR-2-5p，miR-54-3p，miR-87-3p，miR-1-3p) 运用荧光定量PCR的方法，对两种单菌线虫组合体DZ/S1和DZ/186内不同时间点（6d，12d，15d，1d，24d）的miRNAs表达模式进行探究。荧光定量PCR显示，miRNA在2种单菌线虫组合DZ/S1和DZ/186中的表达模式不同， miRNA在DZ/S1体内的表达趋势比较平缓稳定，而在DZ/186体内的表达趋势随着时间的推移，变化非常明显。本研究详细研究了昆虫病原线虫的miRNAs在不同时间点的表达量的变化，为进一步研究miRNA在昆虫病原线虫及其共生菌的共生关系中的作用以及分子调控机制提供更加有价值的依据。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1实验材料5
1.1.1供试材料5
1.1.2培养基5
1.1.3生化试剂及仪器设备5
1.2实验方法5
1.2.1单菌线虫的获得与培养5
1．2．2 QRTPCR分析miRNA表达量的变化 6
2结果与分析8
2.1cDNA合成的5.8S验证8
2.2 miRNA在线虫体内的表达量的变化9
3讨论11
致谢12
参考文献12
崇明拟异小杆线虫不同单菌组合的miRNAs差异表达研究
引言
引言
miRNA长度大约为22个核苷酸，是一类高度保守的，内源性的，非编码的单链小分子RNA[1]。miRNA广泛存在于真核生物中，由具有发夹结构的约70个核苷酸的前体miRNA（premiRNA）加工而成[1]。miRNA主要通过作用于靶基因mRNA的3′UTR引起降解或者抑制靶mRNA翻译，
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
从而在生物体内发挥重要的基因表达调控作用[2,3]。研究发现miRNAs在细胞凋亡[4,5]、癌症发生[6,7]、胚胎发育[8]、干细胞分化[9]、炎症[10]、生长发育[11]、病毒感染[12]等生物学过程中发挥重要作用。1993年，Ambros在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中利用正向遗传学方法发现了第一个miRNA（lin4），并且用经典的定位克隆的方法克隆出lin4基因，然后利用定点突变的方法分析发现其编码的是一种长约22nt的小分子RNA。这种小分子RNA通过不完全互补配对的方式结合在lin14 3’UTR区序列以抑制lin14蛋白水平的表达，导致lin14蛋白质合成减少，最终抑制了秀丽隐杆线虫的幼虫由L1期向L2期的转化[13]。随着人们对miRNA研究的深入以及RNA克隆和测序技术的发展，在真核基因组中已经发现了数以千计的miRNA，并且加快了表达丰度低的小分子RNA发现的进程[1416]，但是仍然有许多miRNA尚未被发现。由于miRNA存在的普遍性、相对保守性和调控功能的多样性，对miRNA的鉴定挖掘及对其功能的探索已成为生命科学研究的热点和前沿。
miRNA表达量的检测是miRNA研究的第一步，由于成熟miRNA长度短，没有poly(A)尾巴，在细胞中的表达水平相对普遍较低，而且同一个家族的miRNA的差别通常只是一到两个碱基，上述这些特性是miRNA检测过程中的挑战。但是尽管如此，随着科学技术的发展，科学家仍然研究出了多种方法来检测miRNA。目前，用于miRNA的表达检测方法有Northern 杂交[17]、miRNA芯片[1820]、实时荧光定量PCR(RealTime RTPCR)以及以罗氏公司的454测序技术[2123]illumina公司的Solexa[2426]基因组测序平台为代表多种新一代测序技术等。本研究采用miRNA的实时荧光定量PCR的方法进行表达量的检测。
在长期的进化过程中，昆虫病原线虫就与共生菌形成了紧密的互惠共生关系。其中嗜线虫致病杆菌属(Xenorhabdus) 与斯氏线虫(Steinernema)共生、发光杆菌属(Photorhabdus)与异小杆线虫(Heterorhabditis)共生、嗜线虫沙雷氏菌(Serratia nematodphila)和拟异小杆线虫（Heterorhabditidoides chongmingensis）共生[2932]。在昆虫病原线虫与共生菌这一类共生体中，起主要杀虫作用的是存在于线虫肠道内与其共生的共生菌。如果共生菌被抑制或去除，昆虫病原线虫就会部分或完全失去致病性。相比于传统农药，昆虫病原线虫共生菌复合体由于具有宿主范围广，对人畜无害，不污染环境，杀虫速度快且能以低成本大规模生产等优点，可以作为一种生态友好型绿色农药来开发。随着人们生态环保意识的增强，环境友好型生物农药取代传统农药是未来农业生产的发展趋势，昆虫病原线虫这类生物防治因子有巨大的发展潜力[33]。目前研究发现，昆虫病原线虫共生菌复合体对大量隐蔽害虫和土壤害虫的防治方面取得显著成绩[3436]。在目前商业化生产昆虫病原线虫的过程中，线虫与共生菌组成单菌线虫培养体系，昆虫病原线虫的带菌率与线虫繁殖代数呈负相关。这一现象直接导致了昆虫病原线虫子代繁殖率和致病性的显著降低，也限制了优良品系的大规模生产。所以目前昆虫病原线虫的应用开发热点集中于对昆虫病原线虫与共生菌之间的稳定性的共生机制的研究，这类研究对于推动生物防治发展具有重要意义。在目前对于昆虫病原线虫和共生菌共生机制的研究中，主要集中于研究共生菌，而对在线虫中与共生相关的机制研究很少。
目前，对线虫miRNA的研究主要集中在秀丽隐杆线虫，关于调控昆虫病原线虫与共生菌共生关系的miRNA的研究的报道很少，并且miRNA在昆虫病原线虫及其共生菌组合中的表达与功能并不十分清楚。因此我们预测miRNA在线虫与共生菌的共生关系中起到重要的调控作用。本研究从miRNA入手，以为Heterorhabditidoides/Serratia两个单菌线虫组合为研究对象研究与共生相关的miRNA。在本实验室前期已通过Solexa 高通量测序技术鉴定了已知候选miRNA ，并且筛选出了差异表达的 miRNA的基础上，本研究挑选了其中5个已知的miRNA，利用 Realtime qRTPCR方法研究其在不同时期表达量的变化，将昆虫病原线虫的miRNA与共生联系起来, 从一个全新的角度去阐释昆虫病原线虫与共生菌的共生机制，为进一步研究miRNA在昆虫病原线虫及其共生菌的共生关系中的作用及分子调控机制奠定基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 供试材料
供试线虫与其共生菌：分离自上海崇明岛采集的土样中的昆虫病原线虫DZ0503CMFT及其共生沙雷氏菌DZ0503SBS1；分离自江苏省如皋市采集的土样中的昆虫病原线虫RG081015及其共生沙雷氏菌DR186。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1实验材料5
1.1.1供试材料5
1.1.2培养基5
1.1.3生化试剂及仪器设备5
1.2实验方法5
1.2.1单菌线虫的获得与培养5
1．2．2 QRTPCR分析miRNA表达量的变化 6
2结果与分析8
2.1cDNA合成的5.8S验证8
2.2 miRNA在线虫体内的表达量的变化9
3讨论11
致谢12
参考文献12
崇明拟异小杆线虫不同单菌组合的miRNAs差异表达研究
引言
引言
miRNA长度大约为22个核苷酸，是一类高度保守的，内源性的，非编码的单链小分子RNA[1]。miRNA广泛存在于真核生物中，由具有发夹结构的约70个核苷酸的前体miRNA（premiRNA）加工而成[1]。miRNA主要通过作用于靶基因mRNA的3′UTR引起降解或者抑制靶mRNA翻译，
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
从而在生物体内发挥重要的基因表达调控作用[2,3]。研究发现miRNAs在细胞凋亡[4,5]、癌症发生[6,7]、胚胎发育[8]、干细胞分化[9]、炎症[10]、生长发育[11]、病毒感染[12]等生物学过程中发挥重要作用。1993年，Ambros在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中利用正向遗传学方法发现了第一个miRNA（lin4），并且用经典的定位克隆的方法克隆出lin4基因，然后利用定点突变的方法分析发现其编码的是一种长约22nt的小分子RNA。这种小分子RNA通过不完全互补配对的方式结合在lin14 3’UTR区序列以抑制lin14蛋白水平的表达，导致lin14蛋白质合成减少，最终抑制了秀丽隐杆线虫的幼虫由L1期向L2期的转化[13]。随着人们对miRNA研究的深入以及RNA克隆和测序技术的发展，在真核基因组中已经发现了数以千计的miRNA，并且加快了表达丰度低的小分子RNA发现的进程[1416]，但是仍然有许多miRNA尚未被发现。由于miRNA存在的普遍性、相对保守性和调控功能的多样性，对miRNA的鉴定挖掘及对其功能的探索已成为生命科学研究的热点和前沿。
miRNA表达量的检测是miRNA研究的第一步，由于成熟miRNA长度短，没有poly(A)尾巴，在细胞中的表达水平相对普遍较低，而且同一个家族的miRNA的差别通常只是一到两个碱基，上述这些特性是miRNA检测过程中的挑战。但是尽管如此，随着科学技术的发展，科学家仍然研究出了多种方法来检测miRNA。目前，用于miRNA的表达检测方法有Northern 杂交[17]、miRNA芯片[1820]、实时荧光定量PCR(RealTime RTPCR)以及以罗氏公司的454测序技术[2123]illumina公司的Solexa[2426]基因组测序平台为代表多种新一代测序技术等。本研究采用miRNA的实时荧光定量PCR的方法进行表达量的检测。
在长期的进化过程中，昆虫病原线虫就与共生菌形成了紧密的互惠共生关系。其中嗜线虫致病杆菌属(Xenorhabdus) 与斯氏线虫(Steinernema)共生、发光杆菌属(Photorhabdus)与异小杆线虫(Heterorhabditis)共生、嗜线虫沙雷氏菌(Serratia nematodphila)和拟异小杆线虫（Heterorhabditidoides chongmingensis）共生[2932]。在昆虫病原线虫与共生菌这一类共生体中，起主要杀虫作用的是存在于线虫肠道内与其共生的共生菌。如果共生菌被抑制或去除，昆虫病原线虫就会部分或完全失去致病性。相比于传统农药，昆虫病原线虫共生菌复合体由于具有宿主范围广，对人畜无害，不污染环境，杀虫速度快且能以低成本大规模生产等优点，可以作为一种生态友好型绿色农药来开发。随着人们生态环保意识的增强，环境友好型生物农药取代传统农药是未来农业生产的发展趋势，昆虫病原线虫这类生物防治因子有巨大的发展潜力[33]。目前研究发现，昆虫病原线虫共生菌复合体对大量隐蔽害虫和土壤害虫的防治方面取得显著成绩[3436]。在目前商业化生产昆虫病原线虫的过程中，线虫与共生菌组成单菌线虫培养体系，昆虫病原线虫的带菌率与线虫繁殖代数呈负相关。这一现象直接导致了昆虫病原线虫子代繁殖率和致病性的显著降低，也限制了优良品系的大规模生产。所以目前昆虫病原线虫的应用开发热点集中于对昆虫病原线虫与共生菌之间的稳定性的共生机制的研究，这类研究对于推动生物防治发展具有重要意义。在目前对于昆虫病原线虫和共生菌共生机制的研究中，主要集中于研究共生菌，而对在线虫中与共生相关的机制研究很少。
目前，对线虫miRNA的研究主要集中在秀丽隐杆线虫，关于调控昆虫病原线虫与共生菌共生关系的miRNA的研究的报道很少，并且miRNA在昆虫病原线虫及其共生菌组合中的表达与功能并不十分清楚。因此我们预测miRNA在线虫与共生菌的共生关系中起到重要的调控作用。本研究从miRNA入手，以为Heterorhabditidoides/Serratia两个单菌线虫组合为研究对象研究与共生相关的miRNA。在本实验室前期已通过Solexa 高通量测序技术鉴定了已知候选miRNA ，并且筛选出了差异表达的 miRNA的基础上，本研究挑选了其中5个已知的miRNA，利用 Realtime qRTPCR方法研究其在不同时期表达量的变化，将昆虫病原线虫的miRNA与共生联系起来, 从一个全新的角度去阐释昆虫病原线虫与共生菌的共生机制，为进一步研究miRNA在昆虫病原线虫及其共生菌的共生关系中的作用及分子调控机制奠定基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 供试材料
供试线虫与其共生菌：分离自上海崇明岛采集的土样中的昆虫病原线虫DZ0503CMFT及其共生沙雷氏菌DZ0503SBS1；分离自江苏省如皋市采集的土样中的昆虫病原线虫RG081015及其共生沙雷氏菌DR186。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/swgc/smkx/248.html
