马铃薯6磷酸海藻糖合成酶sttpp基因的表达谱分析和过表达载体的构建
海藻糖（Trehalose）是一种非还原性二糖，在生物应对非生物胁迫的过程中起到保护作用。海藻糖的合成途径需要两个关键酶，分别是TPP（Trehalose-6-phosphate phosphatase，6-磷酸海藻糖磷酸酯酶）和TPS1（Trehalose-6-phosphate synthase 1，6-磷酸海藻糖合成酶1）。目前的研究发现在马铃薯中过表达酵母的TPS1能够提高马铃薯的耐盐性，但是马铃薯中是否存在自身的海藻糖合成的TPS/TPP酶以及如何在非生物胁迫中发挥功能，这些都是不清楚的。本课题通过与拟南芥的TPP基因序列（NM_128597.3）进行同源比对并克隆获得潜在的马铃薯的TPP基因（StTPP, PGSC0003DMT400035989），利用生物信息学手段分析了蛋白质的结构和功能域以及与其他物种的进化关系。进一步通过半定量PCR方法进行StTPP的组织特异性表达和对逆境激素脱落酸（ABA）的诱导表达分析，发现StTPP在叶和匍匐茎中表达量最高，并且受到ABA的诱导。为了探究StTPP在马铃薯抗非生物胁迫中的功能，我们设计并构建了过表达载体，用于以后的过表达转基因马铃薯株系构建。
目录
摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言4
1 材料与方法5
1．1 材料 5
1．1．1 植物材料5
1．1．2 菌株与载体5
1．1．3 酶与化学试剂5
1．2 方法 6
1．2．1 DNA提取6
1．2．2 RNA提取6
1．2．3 cDNA第一链合成6
1．2．4 胶回收7
1．2．5 质粒的提取7
1．2．6 感受态细胞的转化7
1．2．7 StTPP序列的扩增8
1．2．8 半定量PCR分析StTPP的组织特异性表达8
1．2．9 半定量分析外源逆境激素脱落酸处理下StTPP基因的表达量变化9
1．2．10 构建pCAMBIA1306表达载体9
1．2．11 对StTPP基因进行生 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
物信息学分析9
2 结果与分析10
2．1 StTPP序列的扩增10
2．2 生物信息学分析11
2．2．1 开放阅读框预测11
2．2．2 氨基酸序列11
2．2．3 蛋白质一级结构预测11
2．2．4 限制酶切位点预测12
2．2．5 跨膜区域与信号肽预测12
2．2．6 磷酸化位点预测14
2．2．7 蛋白质亚定位预测15
2．2．8 蛋白质二级结构的预测15
2．2．9 蛋白质三级结构的预测15
2．2．10 氨基酸序列的相似性比对16
2．3 半定量PCR分析StTPP的组织特异性表达16
2．4 半定量分析外源逆境激素脱落酸处理下StTPP基因的表达量变化17
2．5 构建pCAMBIA1306表达载体17
3 讨论 18
3．1 马铃薯StTPP的酶功能分析18
3．2 马铃薯StTPP基因表达模式19
3．3 StTPP功能及对植物抗逆能力的影响19
致谢19
参考文献19
附录119
马铃薯6磷酸海藻糖合成酶StTPP基因的表达谱分析和过表达载体的构建
国家生命科学与技术人才培养基地 魏晓西
引言
马铃薯作为全球四大重要的粮食作物，仅次于小麦、稻谷和玉米，其块茎部分可供食用。在我国，马铃薯已逐步成为我国城乡调剂和丰富人民日常食物结构的主食之一，在日常膳食结构中也占有一席之地[1]。但是目前，马铃薯生产面临一个严峻的问题——非生物胁迫。在非生物胁迫下，马铃薯植株存活率和结薯率下降，株高降幅，植株会代谢失调，主要表现为水分代谢失调、光合速率下降和呼吸速率大起大落；继而细胞代谢紊乱，生物大分子变性失活，导致膜结构瓦解崩塌，严重影响粮食作物产量[2]。而植物为抵抗不良环境，会在体内积累渗透保护剂，海藻糖（Trehalose）就是其中一种 [3]。
海藻糖的分子式为C12H22O11，作为一种非还原性二糖，是生物体为抵抗不良环境产生的应激代谢产物[4]。海藻糖广泛存在于各种微生物及动植物体内，尤其是处于逆境中的生物体。当处于逆境时，生物体可通过调节体内的海藻糖含量来增加细胞膜的稳定性，从而抵抗不良环境。生物体内的海藻糖合成途径共有五种，其中TPS/TPP途径为主要途径[5]。在这个途径中，TPS（Trehalose6phosphate synthase，6磷酸海藻糖合成酶）以尿苷二磷酸葡萄糖和6磷酸葡萄糖为底物，生成海藻糖前体即6磷酸海藻糖，再利用TPP（Trehalose6phosphate phosphatase，6磷酸海藻糖磷酸酯酶）水解生成海藻糖。因此，TPP是海藻糖主要合成途径中的一种关键酶。
目前的研究发现，TPP不仅调控海藻糖合成途径，还参与其他生命活动调节过程。张海红等人通过构建TPP过表达低温微生物节杆菌（Arthrobacter sp. A3），发现菌株在0 ℃存活率增加，同时还保持TPP酶活性，说明TPP在低温逆境中发挥抗逆作用[6]；Vandesteene,L.等人以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为模板，对10个TPP基因及其基因产物（TPPATPPJ）的异源表达进行分析，发现海藻糖6磷酸（T6P）是高等植物生长发育的一种关键调节因子，TPP基因过表达促进T6P磷酸化，从而抑制酵母TPS2突变体的热敏性，说明TPP在T6P水平调控中发挥作用[7]；在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，发现11个相关基因，编码产物具有相似的TPP保守区域，所有编码活性TPP酶对于催化结构域中的一些保守残基都具有重要作用，且通过探究敲除TPP基因和单一TPP过表达的拟南芥植株，发现海藻糖代谢和ABA调控信号的密切联系[8]。
在高等植物包括马铃薯中，海藻糖含量普遍较低甚至没有[911]。Goddijin等将酵母的TPS1基因导入马铃薯，发现TPS1的过表达能够增加马铃薯体内的海藻糖含量，从而增加马铃薯的抗逆能力[12]，但是Fernandez等人研究发现，海藻糖合成酶过表达可能会导致马铃薯发育迟缓和畸形[13]。Yeo等人观察TPS1过表达植株在培养管中表现出各种形态表型，包括正常生长和严重发育迟缓的生长，但将它们移植到土壤混合物中培养时，发现植株都正常生长，同时发现TPS1转基因马铃薯植株表现出显著的耐旱性，说明海藻糖的产生不仅影响了植物的发育，也提高了植物的耐旱性[14]。目前的研究没有报道过马铃薯中海藻糖合成的相关基因，而利用生物体自身的内源基因来进行分子改造是目前认为最安全的一种基因工程技术，因此研究马铃薯中自身的TPP/TPS基因来提高马铃薯内的海藻糖含量从而促进其耐胁迫能力就显得尤为重要。
目录
摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言4
1 材料与方法5
1．1 材料 5
1．1．1 植物材料5
1．1．2 菌株与载体5
1．1．3 酶与化学试剂5
1．2 方法 6
1．2．1 DNA提取6
1．2．2 RNA提取6
1．2．3 cDNA第一链合成6
1．2．4 胶回收7
1．2．5 质粒的提取7
1．2．6 感受态细胞的转化7
1．2．7 StTPP序列的扩增8
1．2．8 半定量PCR分析StTPP的组织特异性表达8
1．2．9 半定量分析外源逆境激素脱落酸处理下StTPP基因的表达量变化9
1．2．10 构建pCAMBIA1306表达载体9
1．2．11 对StTPP基因进行生 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
物信息学分析9
2 结果与分析10
2．1 StTPP序列的扩增10
2．2 生物信息学分析11
2．2．1 开放阅读框预测11
2．2．2 氨基酸序列11
2．2．3 蛋白质一级结构预测11
2．2．4 限制酶切位点预测12
2．2．5 跨膜区域与信号肽预测12
2．2．6 磷酸化位点预测14
2．2．7 蛋白质亚定位预测15
2．2．8 蛋白质二级结构的预测15
2．2．9 蛋白质三级结构的预测15
2．2．10 氨基酸序列的相似性比对16
2．3 半定量PCR分析StTPP的组织特异性表达16
2．4 半定量分析外源逆境激素脱落酸处理下StTPP基因的表达量变化17
2．5 构建pCAMBIA1306表达载体17
3 讨论 18
3．1 马铃薯StTPP的酶功能分析18
3．2 马铃薯StTPP基因表达模式19
3．3 StTPP功能及对植物抗逆能力的影响19
致谢19
参考文献19
附录119
马铃薯6磷酸海藻糖合成酶StTPP基因的表达谱分析和过表达载体的构建
国家生命科学与技术人才培养基地 魏晓西
引言
马铃薯作为全球四大重要的粮食作物，仅次于小麦、稻谷和玉米，其块茎部分可供食用。在我国，马铃薯已逐步成为我国城乡调剂和丰富人民日常食物结构的主食之一，在日常膳食结构中也占有一席之地[1]。但是目前，马铃薯生产面临一个严峻的问题——非生物胁迫。在非生物胁迫下，马铃薯植株存活率和结薯率下降，株高降幅，植株会代谢失调，主要表现为水分代谢失调、光合速率下降和呼吸速率大起大落；继而细胞代谢紊乱，生物大分子变性失活，导致膜结构瓦解崩塌，严重影响粮食作物产量[2]。而植物为抵抗不良环境，会在体内积累渗透保护剂，海藻糖（Trehalose）就是其中一种 [3]。
海藻糖的分子式为C12H22O11，作为一种非还原性二糖，是生物体为抵抗不良环境产生的应激代谢产物[4]。海藻糖广泛存在于各种微生物及动植物体内，尤其是处于逆境中的生物体。当处于逆境时，生物体可通过调节体内的海藻糖含量来增加细胞膜的稳定性，从而抵抗不良环境。生物体内的海藻糖合成途径共有五种，其中TPS/TPP途径为主要途径[5]。在这个途径中，TPS（Trehalose6phosphate synthase，6磷酸海藻糖合成酶）以尿苷二磷酸葡萄糖和6磷酸葡萄糖为底物，生成海藻糖前体即6磷酸海藻糖，再利用TPP（Trehalose6phosphate phosphatase，6磷酸海藻糖磷酸酯酶）水解生成海藻糖。因此，TPP是海藻糖主要合成途径中的一种关键酶。
目前的研究发现，TPP不仅调控海藻糖合成途径，还参与其他生命活动调节过程。张海红等人通过构建TPP过表达低温微生物节杆菌（Arthrobacter sp. A3），发现菌株在0 ℃存活率增加，同时还保持TPP酶活性，说明TPP在低温逆境中发挥抗逆作用[6]；Vandesteene,L.等人以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为模板，对10个TPP基因及其基因产物（TPPATPPJ）的异源表达进行分析，发现海藻糖6磷酸（T6P）是高等植物生长发育的一种关键调节因子，TPP基因过表达促进T6P磷酸化，从而抑制酵母TPS2突变体的热敏性，说明TPP在T6P水平调控中发挥作用[7]；在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，发现11个相关基因，编码产物具有相似的TPP保守区域，所有编码活性TPP酶对于催化结构域中的一些保守残基都具有重要作用，且通过探究敲除TPP基因和单一TPP过表达的拟南芥植株，发现海藻糖代谢和ABA调控信号的密切联系[8]。
在高等植物包括马铃薯中，海藻糖含量普遍较低甚至没有[911]。Goddijin等将酵母的TPS1基因导入马铃薯，发现TPS1的过表达能够增加马铃薯体内的海藻糖含量，从而增加马铃薯的抗逆能力[12]，但是Fernandez等人研究发现，海藻糖合成酶过表达可能会导致马铃薯发育迟缓和畸形[13]。Yeo等人观察TPS1过表达植株在培养管中表现出各种形态表型，包括正常生长和严重发育迟缓的生长，但将它们移植到土壤混合物中培养时，发现植株都正常生长，同时发现TPS1转基因马铃薯植株表现出显著的耐旱性，说明海藻糖的产生不仅影响了植物的发育，也提高了植物的耐旱性[14]。目前的研究没有报道过马铃薯中海藻糖合成的相关基因，而利用生物体自身的内源基因来进行分子改造是目前认为最安全的一种基因工程技术，因此研究马铃薯中自身的TPP/TPS基因来提高马铃薯内的海藻糖含量从而促进其耐胁迫能力就显得尤为重要。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/swgc/smkx/66.html
