利用酵母验证水稻基因的耐镉性
随着近几十年来分子生物学的飞速发展，利用分子手段进行基因的扩增愈加高效，原核生物和真核生物表达体系的建立也日趋成熟，在生物科研领域起着越来越重要的作用。同时，伴随着发展了百年的工业化，越来越严重的重金属污染也成为了全人类需要共同面对的问题，水稻等主要粮食作物体内过高的镉积累影响着全球几十亿人的生命。使用分子生物学方法，探索植物耐受重金属的机理，提高植物耐镉性，减少镉积累，已成为重要命题。本文记录了利用分子生物学方法，以与水稻耐镉性相关的基因，如转录ATP合酶、光系统I装配蛋白、ABA-胁迫-成熟诱导蛋白的基因为研究对象，利用大肠杆菌连接目的载体，导入真核生物酿酒酵母内，用一定镉含量的培养基进行测试。结果发现，四个基因表达后均能增加酵母镉敏感株的耐镉性，其中机理有待进一步探索。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1 实验材料2
1.2 实验方法2
1.2.1 目的基因的扩增与回收2
1.2.2 质粒的构建3
1.2.3 酵母的转化与培养4
2 结果与分析5
2.1酵母转化子培养结果5
2.2酵母异源功能互补实验6
3 讨论 7
致谢9
参考文献10
利用酵母验证水稻基因的耐镉性
引言
引言：镉作为一种重金属元素，在自然界含量稀少，分布广而散,各种生物、土壤和水体中都含有微量镉，在环境中容易累积,且不能降解。镉在植株体内的作用是缓慢增加的,细胞还没有表现出明显的受毒害的症状时，实际上植株体内已经积累了大量的镉。粗放的工业化向环境中排出了大量未经处理的污染物，用含过量重金属的污水灌溉、将重金属污染区域辟为农田以及肥料的不当施用等导致稻田受重金属污染的问题更加严重[1]。水稻是中国种植量最大的粮食作物之一，也是玉米、小麦等世界上最主要的粮食作物之一，地球上有一半的人把稻米当做日常主食[2]。土壤中过高含量的镉，不仅会被水稻富集，在其各组织细胞中积累, 影响植株的生长，导致亩产量降低；还会通过生物链最终富集到人体内，且无法被代谢排 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
出，造成慢性毒害[3]。探索水稻耐镉的机理，研究水稻植株中关于镉耐受的基因表达，有助于定位水稻基因组中指导转录相关蛋白的基因；进行转基因研究，培育出耐镉且不易富集的品种；可以改善现有植株中果实重金属积累过多、危害人体健康的状况。
ABA胁迫成熟诱导（ASR）蛋白是一类渗透调节蛋白家族，在逆境胁迫下，其在水稻细胞内的含量会增加，形成单体或二聚体以保护细胞膜结构，参与逆境响应。而ATP合酶广泛分布于线粒体、叶绿体的膜结构上，参与光系统的氧化磷酸化和光合磷酸化，合成ATP为生命活动提供能量。有研究表明，当水稻植株遭遇逆境时，抗逆性强的品种其光合作用仍保持较高水平，ATP合酶表达量在一段时间内降低幅度小[4]。这三个蛋白家族都与水稻耐镉有关系，故将其作为研究对象。
现在各种生化和分子的研究方法发展趋近成熟，如聚合酶链式反应技术（PCR）、琼脂糖凝胶电泳技术、大肠杆菌和酿酒酵母的转化和培养等。大肠杆菌和酵母作为常用的模式生物，是很好的外源基因表达系统，不仅繁殖迅速，易于获得和培养，操作简单，而且可以稳定地复制表达[5]，非常适合作为目的基因的扩增和验证工具。本研究以水稻中与耐镉机制相关的基因为研究对象，通过PCR技术扩增得到大量相同片段，连接上pMD19T载体以后利用大肠杆菌感受态细胞转化得到质粒，经酶切验证后连接到目的载体pYES2上，再利用大肠杆菌，转化得到质粒，转入酿酒酵母中，挑取单菌落培养，得到菌液后配成浓度梯度溶液，在含镉培养基上培养，观察转化子的耐镉情况。
1 材料与方法
1．1 实验材料
基因材料：水稻植株的DNA
感受态细胞及菌株：大肠杆菌E.coli DH5α pMD19T Vector购自康为世纪生物科技有限公司；酵母菌株Δycf1、yod。
其他试剂：琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，测序工作交由南京思普金生物科技有限公司，其余试剂和材料均购自国产或进口公司。
主要仪器和设备：PCR仪，离心机，电泳仪，水浴锅，超净工作台，灭菌锅，恒温震荡培养箱。
1．2 实验方法
1.2.1 目的基因的扩增与回收
PCR扩增出目的基因，反应体系为：
LA Taq polymerase 0.15 μL
dNTP 0.6 μL
5×GC Buffer 3 μL
引物1 0.6 μL
引物2 0.6 μL
cDNA 0.6 μL
ddH2O 9.5 μL
Total 15 μL
PCR程序如下：
94℃ 5 min
94℃ 30s
58℃ 30s 33 cycles
72℃ 1min
72℃ 10 min
胶回收步骤如下：
反应结束后，用中孔1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在紫外灯下用手术刀切下含有目的条带的凝胶，放入2 ml Ep管中，加入400 μL 试剂盒中的溶胶液，55 ℃水浴约10 min，每隔2~3 min翻转混匀，使胶融化；
待凝胶融化后，将溶液转移到试剂盒中的吸附柱中，室温放置2min使其冷却，用离心机6000 rpm离心1 min，为保证回收率需倒回重复一次，弃掉废液；
向柱中加入500 μL Wash Solution，12000 rpm离心1 min，重复一次，再空甩一次，以保证去尽洗液；
将吸附柱取出，放入1.5 ml Ep管，于通风处放置5 min至无酒精味，在膜中央加入30 μL 超纯水，盖上盖子，放在37 ℃培养箱中温育2 min，再用离心机12000 rpm离心1 min，为保证回收率吸回溶液重复一次，即得目的片段的溶液；
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1 实验材料2
1.2 实验方法2
1.2.1 目的基因的扩增与回收2
1.2.2 质粒的构建3
1.2.3 酵母的转化与培养4
2 结果与分析5
2.1酵母转化子培养结果5
2.2酵母异源功能互补实验6
3 讨论 7
致谢9
参考文献10
利用酵母验证水稻基因的耐镉性
引言
引言：镉作为一种重金属元素，在自然界含量稀少，分布广而散,各种生物、土壤和水体中都含有微量镉，在环境中容易累积,且不能降解。镉在植株体内的作用是缓慢增加的,细胞还没有表现出明显的受毒害的症状时，实际上植株体内已经积累了大量的镉。粗放的工业化向环境中排出了大量未经处理的污染物，用含过量重金属的污水灌溉、将重金属污染区域辟为农田以及肥料的不当施用等导致稻田受重金属污染的问题更加严重[1]。水稻是中国种植量最大的粮食作物之一，也是玉米、小麦等世界上最主要的粮食作物之一，地球上有一半的人把稻米当做日常主食[2]。土壤中过高含量的镉，不仅会被水稻富集，在其各组织细胞中积累, 影响植株的生长，导致亩产量降低；还会通过生物链最终富集到人体内，且无法被代谢排 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
出，造成慢性毒害[3]。探索水稻耐镉的机理，研究水稻植株中关于镉耐受的基因表达，有助于定位水稻基因组中指导转录相关蛋白的基因；进行转基因研究，培育出耐镉且不易富集的品种；可以改善现有植株中果实重金属积累过多、危害人体健康的状况。
ABA胁迫成熟诱导（ASR）蛋白是一类渗透调节蛋白家族，在逆境胁迫下，其在水稻细胞内的含量会增加，形成单体或二聚体以保护细胞膜结构，参与逆境响应。而ATP合酶广泛分布于线粒体、叶绿体的膜结构上，参与光系统的氧化磷酸化和光合磷酸化，合成ATP为生命活动提供能量。有研究表明，当水稻植株遭遇逆境时，抗逆性强的品种其光合作用仍保持较高水平，ATP合酶表达量在一段时间内降低幅度小[4]。这三个蛋白家族都与水稻耐镉有关系，故将其作为研究对象。
现在各种生化和分子的研究方法发展趋近成熟，如聚合酶链式反应技术（PCR）、琼脂糖凝胶电泳技术、大肠杆菌和酿酒酵母的转化和培养等。大肠杆菌和酵母作为常用的模式生物，是很好的外源基因表达系统，不仅繁殖迅速，易于获得和培养，操作简单，而且可以稳定地复制表达[5]，非常适合作为目的基因的扩增和验证工具。本研究以水稻中与耐镉机制相关的基因为研究对象，通过PCR技术扩增得到大量相同片段，连接上pMD19T载体以后利用大肠杆菌感受态细胞转化得到质粒，经酶切验证后连接到目的载体pYES2上，再利用大肠杆菌，转化得到质粒，转入酿酒酵母中，挑取单菌落培养，得到菌液后配成浓度梯度溶液，在含镉培养基上培养，观察转化子的耐镉情况。
1 材料与方法
1．1 实验材料
基因材料：水稻植株的DNA
感受态细胞及菌株：大肠杆菌E.coli DH5α pMD19T Vector购自康为世纪生物科技有限公司；酵母菌株Δycf1、yod。
其他试剂：琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，测序工作交由南京思普金生物科技有限公司，其余试剂和材料均购自国产或进口公司。
主要仪器和设备：PCR仪，离心机，电泳仪，水浴锅，超净工作台，灭菌锅，恒温震荡培养箱。
1．2 实验方法
1.2.1 目的基因的扩增与回收
PCR扩增出目的基因，反应体系为：
LA Taq polymerase 0.15 μL
dNTP 0.6 μL
5×GC Buffer 3 μL
引物1 0.6 μL
引物2 0.6 μL
cDNA 0.6 μL
ddH2O 9.5 μL
Total 15 μL
PCR程序如下：
94℃ 5 min
94℃ 30s
58℃ 30s 33 cycles
72℃ 1min
72℃ 10 min
胶回收步骤如下：
反应结束后，用中孔1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在紫外灯下用手术刀切下含有目的条带的凝胶，放入2 ml Ep管中，加入400 μL 试剂盒中的溶胶液，55 ℃水浴约10 min，每隔2~3 min翻转混匀，使胶融化；
待凝胶融化后，将溶液转移到试剂盒中的吸附柱中，室温放置2min使其冷却，用离心机6000 rpm离心1 min，为保证回收率需倒回重复一次，弃掉废液；
向柱中加入500 μL Wash Solution，12000 rpm离心1 min，重复一次，再空甩一次，以保证去尽洗液；
将吸附柱取出，放入1.5 ml Ep管，于通风处放置5 min至无酒精味，在膜中央加入30 μL 超纯水，盖上盖子，放在37 ℃培养箱中温育2 min，再用离心机12000 rpm离心1 min，为保证回收率吸回溶液重复一次，即得目的片段的溶液；
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