生防枯草芽孢杆菌菌株的筛选鉴定及生防效果验证
目 录
1 引言1
1.1 枯草芽孢杆菌生理生化特性..1
1.2 草芽孢杆菌促进植物抗病和抗逆..2
1.3草芽孢杆菌的作用机理...2
1.4 课题研究的目的以及意义 4
2 试验材料和方法4
2.1试验材料4 2.2主要设备...6
2.3试验方法与步骤...6
3 结果9
3.1菌株的筛选9
3.2 Q01形态特征观察10
3.3 Q01生理生化鉴定10
3.4抗生素抗性鉴定..10
3.5生防效果验证.11
4讨论11
结论 .13
致谢 .14
参考文献.15
附图 .18
1 引言
枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis) 于1941 年在非洲战役时被德国医疗军团发现，从马和骆驼的粪便中分离出来[1]。枯草芽孢杆菌是一种嗜热、好氧并产芽孢的G+ 杆状细菌，其生理特征丰富多样，极易分离培养, 能产生多种抗菌素和酶。枯草芽孢杆菌应用于植物病害生物防治的研究已经有很多年的历史，目前在黄瓜、辣椒、水稻、小麦和玉米等农作物病害上显出较好的防治效果。近年来，科学家们从枯草芽孢杆菌产生拮抗物质的类型、分子作用机理及田间应用等方面开展了广泛而深入的研究，为进一步明确枯草芽孢杆菌的作用机制和作用效果提供了科学依据。
竞争作用是生防微生物发挥作用的重要机制之一。微生物竞争作用主要包括营养竞争和位点竞争。营养竞争只在少数菌株中发现，有些菌株通过产生一种铁载体与植物病 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
原菌竞争铁元素，抑制病原菌的生长,从而使枯草芽孢杆菌占据一定的生态位[2]。
枯草芽孢杆菌对环境有很强的抗逆能力，同时对多种植物病原菌有很强的拮抗作用，具有很好的开发前景。随着对枯草芽孢杆菌及其产生的有效抗菌物质的深入研究，其植病生防优势越来越明显，并展现出广阔的应用前景。
1.1 枯草芽孢杆菌的生理生化特性
芽孢杆菌由于其好氧，营养要求粗放，生活能力强，且能够分泌蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等多种微生物酶而在实际生产中得到了广泛的应用。芽孢杆菌可降解甘油三酯、蛋白质、淀粉、木聚糖、果胶等高分子物质，尤其对植物性碳水化合物具有较强的降解能力[3] 。芽孢杆菌细胞成直杆状，常以成对或链式排列，具圆端或方端，芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形，能抗许多不良环境[4]。通常每个细胞产生一个芽孢，生孢不被氧所抑制，属于化能异养菌,好氧或兼性厌氧，具发酵或呼吸代谢类型。芽孢杆菌在自然界中分布非常广泛，土壤、空气、肥料、饲料、食物等生境中都有存在，甚至在沙漠沙土、海洋沉淀物等较为恶劣环境中也有存在[5]。与其他微生物活菌制剂相比，芽孢杆菌具有在条件不利的环境下形成芽孢将自己保护起来的特点，且复活率高。同时还具有耐酸、耐盐、耐高温 (100 ℃) 及耐积压等优点。芽抱杆菌能产生多种抗菌物质，其中大部分是多肽，主要抑制革兰氏阳性菌；有些多肤还能抑制革兰氏阴性菌、霉菌和酵母。其中有一些抗菌肤己被应用于治疗人类、动物和植物的疾病，同时也可作为生物表面活性剂、食品防腐剂、饲料添加剂和分子生物学的研究工具[6]。作为微生物世界的一个特殊的细菌类群，芽孢杆菌能够产生对热、紫外线、电磁辐射某些化学药品有很强抗性的芽孢,抗逆能力强，繁殖速度快，营养要求简单。芽孢杆菌对农作物安全，除了炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis) 外，其余均为人畜非致病菌，还可以产生杆菌肤、大环脂、环肤、类噬菌体颗粒等十几种抗菌物质[7]。
1.2 枯草芽孢杆菌促进植物抗病和抗逆
植物病害是农作物生产的主要危胁，化学农药依然是目前防治的首要手段，但它的普遍使用带来了土壤、水体和大气的污染，而枯草芽胞杆菌杀菌剂克服了传统化学农药污染环境、危害人畜、易产生抗性等缺点，具有选择性强、安全、原料简单等优点，在微生物杀菌剂市场斩露头角。应用枯草芽胞杆菌防治植物病害的研究具有悠久的历史，目前全世界收集保存了几百株野生型枯草芽胞杆菌菌株，研究证实该种革兰氏阳性细菌能够产生40多种具有不同结构的抗菌物质，其中很多具有优良性状的菌株已经应用于生产实践，例如，美国的GB03、MBI600、QST713 和 B. subtilis var. amyloliquefaciens FZB24,澳大利亚开发的 B. subtilis A213， 日本东京技术研究所的 B. subtilis RB-14,中国开发的B916、B908、B3、B903、XM16 等[8]。利用微生态环境的调控来抑制有害微生物(病原菌)，促进有益微生物生长，从而达到宿主健壮的目的，使调控微生态环境的生态平衡朝着有利于宿主的方向发展，是当今研究的重要方向。有研究发现，部分芽孢杆菌产生的代谢物对植物病原菌，如棉花枯萎病、辣椒疫霉等孢子萌发以及动物病原菌白痢有强烈的抑制作用[9]。国内外许多学者自80年代就已经开始对芽抱杆菌进行各种研究、探索。国外研究表明，芽饱杆菌能有效地抑制柑桔灰霉病和绿霉病[10]、梨炭疽病[11]、葡萄灰霉病[12]、芒果炭疽病[13]、桃褐腐病[14]、蚕豆锈病[15]、西瓜枯萎病[16-18]、番茄灰霉病[19]、及苋病害[20]、黄瓜[21]、水稻纹枯病[22]、小麦赤霉病[23]等多种植物病害。
抗生素是一类异源小分子化合物，在低浓度下可以对微生物的生长或代谢产生影响[24]。在植物病害的生物防治中，根部定殖微生物产生的抗生素起着重要的作用，这可以用抗生素产生突变体获得证明。内生菌产生的抗生素类物质存在植物体内，在植物体内转运，有利于发挥防病作用[25]。
1.3 枯草芽孢杆菌的作用机理
目前，枯草芽胞杆菌的利用途径除了作为活菌体制剂使用之外，主要是进行发酵产生活性抗菌物质。其分泌的抗菌物质包括低分子量抗菌素和高分子量抗菌蛋白质[26]。枯草芽抱杆菌产生的低分子量抗菌素主要有脂肽类抗生素、细菌素以及低分子抗菌肽等，高分子抗菌蛋白质主要是酶类。
枯草芽胞杆菌旳代谢物质分为以下6类：
1、脂肽类（lipopeptin):非核糖体途径合成，伊枯草菌素(Iturin)是一类小分子环脂肽类物质，由7个氨基酸和1个β—氨基脂肪酸 (PAA，β-amino fatty acids) 组成，其中包括伊枯草菌素A、B、C、D、E和芽孢菌素 (bacillomycin) D、F、L等[27]。由于分子结构特殊，脂肽在抗生素、化妆品及微生物釆油等领域有重要应用。脂肽类抗生素抗菌作用的原理是其对细胞膜结构特性的影响，通过改变细胞膜通透性抑制病原菌的生长[28]。
2、细菌素：在2000年，Oscariz曾提出观点，细菌素是不同的细菌通过核糖体合成的肽类抗生素，分子量小，具热稳定性和高度疏水性[29-30]。据报道，枯草芽胞杆菌产生的细菌素有Subtilin和Subtilosin，其中枯草菌素(Subtilin)是迄今为止研究较为集中的细菌素之一，前体由56个Aa小肽组成，其中24个Aa为信号肽，经信号肽酵切除和一系列修饰如Thr脱水和Ser与Cys硫酯化可以形成32个Aa的活性小肽。
1 引言1
1.1 枯草芽孢杆菌生理生化特性..1
1.2 草芽孢杆菌促进植物抗病和抗逆..2
1.3草芽孢杆菌的作用机理...2
1.4 课题研究的目的以及意义 4
2 试验材料和方法4
2.1试验材料4 2.2主要设备...6
2.3试验方法与步骤...6
3 结果9
3.1菌株的筛选9
3.2 Q01形态特征观察10
3.3 Q01生理生化鉴定10
3.4抗生素抗性鉴定..10
3.5生防效果验证.11
4讨论11
结论 .13
致谢 .14
参考文献.15
附图 .18
1 引言
枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis) 于1941 年在非洲战役时被德国医疗军团发现，从马和骆驼的粪便中分离出来[1]。枯草芽孢杆菌是一种嗜热、好氧并产芽孢的G+ 杆状细菌，其生理特征丰富多样，极易分离培养, 能产生多种抗菌素和酶。枯草芽孢杆菌应用于植物病害生物防治的研究已经有很多年的历史，目前在黄瓜、辣椒、水稻、小麦和玉米等农作物病害上显出较好的防治效果。近年来，科学家们从枯草芽孢杆菌产生拮抗物质的类型、分子作用机理及田间应用等方面开展了广泛而深入的研究，为进一步明确枯草芽孢杆菌的作用机制和作用效果提供了科学依据。
竞争作用是生防微生物发挥作用的重要机制之一。微生物竞争作用主要包括营养竞争和位点竞争。营养竞争只在少数菌株中发现，有些菌株通过产生一种铁载体与植物病 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
原菌竞争铁元素，抑制病原菌的生长,从而使枯草芽孢杆菌占据一定的生态位[2]。
枯草芽孢杆菌对环境有很强的抗逆能力，同时对多种植物病原菌有很强的拮抗作用，具有很好的开发前景。随着对枯草芽孢杆菌及其产生的有效抗菌物质的深入研究，其植病生防优势越来越明显，并展现出广阔的应用前景。
1.1 枯草芽孢杆菌的生理生化特性
芽孢杆菌由于其好氧，营养要求粗放，生活能力强，且能够分泌蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等多种微生物酶而在实际生产中得到了广泛的应用。芽孢杆菌可降解甘油三酯、蛋白质、淀粉、木聚糖、果胶等高分子物质，尤其对植物性碳水化合物具有较强的降解能力[3] 。芽孢杆菌细胞成直杆状，常以成对或链式排列，具圆端或方端，芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形，能抗许多不良环境[4]。通常每个细胞产生一个芽孢，生孢不被氧所抑制，属于化能异养菌,好氧或兼性厌氧，具发酵或呼吸代谢类型。芽孢杆菌在自然界中分布非常广泛，土壤、空气、肥料、饲料、食物等生境中都有存在，甚至在沙漠沙土、海洋沉淀物等较为恶劣环境中也有存在[5]。与其他微生物活菌制剂相比，芽孢杆菌具有在条件不利的环境下形成芽孢将自己保护起来的特点，且复活率高。同时还具有耐酸、耐盐、耐高温 (100 ℃) 及耐积压等优点。芽抱杆菌能产生多种抗菌物质，其中大部分是多肽，主要抑制革兰氏阳性菌；有些多肤还能抑制革兰氏阴性菌、霉菌和酵母。其中有一些抗菌肤己被应用于治疗人类、动物和植物的疾病，同时也可作为生物表面活性剂、食品防腐剂、饲料添加剂和分子生物学的研究工具[6]。作为微生物世界的一个特殊的细菌类群，芽孢杆菌能够产生对热、紫外线、电磁辐射某些化学药品有很强抗性的芽孢,抗逆能力强，繁殖速度快，营养要求简单。芽孢杆菌对农作物安全，除了炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis) 外，其余均为人畜非致病菌，还可以产生杆菌肤、大环脂、环肤、类噬菌体颗粒等十几种抗菌物质[7]。
1.2 枯草芽孢杆菌促进植物抗病和抗逆
植物病害是农作物生产的主要危胁，化学农药依然是目前防治的首要手段，但它的普遍使用带来了土壤、水体和大气的污染，而枯草芽胞杆菌杀菌剂克服了传统化学农药污染环境、危害人畜、易产生抗性等缺点，具有选择性强、安全、原料简单等优点，在微生物杀菌剂市场斩露头角。应用枯草芽胞杆菌防治植物病害的研究具有悠久的历史，目前全世界收集保存了几百株野生型枯草芽胞杆菌菌株，研究证实该种革兰氏阳性细菌能够产生40多种具有不同结构的抗菌物质，其中很多具有优良性状的菌株已经应用于生产实践，例如，美国的GB03、MBI600、QST713 和 B. subtilis var. amyloliquefaciens FZB24,澳大利亚开发的 B. subtilis A213， 日本东京技术研究所的 B. subtilis RB-14,中国开发的B916、B908、B3、B903、XM16 等[8]。利用微生态环境的调控来抑制有害微生物(病原菌)，促进有益微生物生长，从而达到宿主健壮的目的，使调控微生态环境的生态平衡朝着有利于宿主的方向发展，是当今研究的重要方向。有研究发现，部分芽孢杆菌产生的代谢物对植物病原菌，如棉花枯萎病、辣椒疫霉等孢子萌发以及动物病原菌白痢有强烈的抑制作用[9]。国内外许多学者自80年代就已经开始对芽抱杆菌进行各种研究、探索。国外研究表明，芽饱杆菌能有效地抑制柑桔灰霉病和绿霉病[10]、梨炭疽病[11]、葡萄灰霉病[12]、芒果炭疽病[13]、桃褐腐病[14]、蚕豆锈病[15]、西瓜枯萎病[16-18]、番茄灰霉病[19]、及苋病害[20]、黄瓜[21]、水稻纹枯病[22]、小麦赤霉病[23]等多种植物病害。
抗生素是一类异源小分子化合物，在低浓度下可以对微生物的生长或代谢产生影响[24]。在植物病害的生物防治中，根部定殖微生物产生的抗生素起着重要的作用，这可以用抗生素产生突变体获得证明。内生菌产生的抗生素类物质存在植物体内，在植物体内转运，有利于发挥防病作用[25]。
1.3 枯草芽孢杆菌的作用机理
目前，枯草芽胞杆菌的利用途径除了作为活菌体制剂使用之外，主要是进行发酵产生活性抗菌物质。其分泌的抗菌物质包括低分子量抗菌素和高分子量抗菌蛋白质[26]。枯草芽抱杆菌产生的低分子量抗菌素主要有脂肽类抗生素、细菌素以及低分子抗菌肽等，高分子抗菌蛋白质主要是酶类。
枯草芽胞杆菌旳代谢物质分为以下6类：
1、脂肽类（lipopeptin):非核糖体途径合成，伊枯草菌素(Iturin)是一类小分子环脂肽类物质，由7个氨基酸和1个β—氨基脂肪酸 (PAA，β-amino fatty acids) 组成，其中包括伊枯草菌素A、B、C、D、E和芽孢菌素 (bacillomycin) D、F、L等[27]。由于分子结构特殊，脂肽在抗生素、化妆品及微生物釆油等领域有重要应用。脂肽类抗生素抗菌作用的原理是其对细胞膜结构特性的影响，通过改变细胞膜通透性抑制病原菌的生长[28]。
2、细菌素：在2000年，Oscariz曾提出观点，细菌素是不同的细菌通过核糖体合成的肽类抗生素，分子量小，具热稳定性和高度疏水性[29-30]。据报道，枯草芽胞杆菌产生的细菌素有Subtilin和Subtilosin，其中枯草菌素(Subtilin)是迄今为止研究较为集中的细菌素之一，前体由56个Aa小肽组成，其中24个Aa为信号肽，经信号肽酵切除和一系列修饰如Thr脱水和Ser与Cys硫酯化可以形成32个Aa的活性小肽。
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