大丽轮枝菌致病相关基因VdUGPU的克隆及其功能的初步研究
目 录
1 绪论 1
1.1 棉花黄萎病的研究现状 1
1.1.1 棉花黄萎病的发现、分布及其危害 1
1.1.2 棉花黄萎病的发病症状 1
1.1.3 棉花黄萎病的防治措施 2
1.2 大丽轮枝菌的研究现状 2
1.3 课题研究的目的及意义 2
2 实验材料、试剂和方法 3
2.1 实验的相关试剂及配置 3
2.1.1 常用培养基的配置 3
2.1.2 抗生素的配置及使用浓度 4
2.2 实验步骤和方法 4
2.2.1 大丽轮枝菌总RNA的提取 4
2.2.2 cDNA反转录实验 5
2.2.3 质粒提取 6
2.2.4 1300-HYG-PS质粒酶切 6
2.2.5 VdUGPU片段无缝连接至1300-HYG-PS质粒 7
2.2.6 大肠杆菌的转化 7
2.2.7 对转化长出的菌落或提取的质粒进行PCR验证 7
2.2.8 农杆菌AGL-1的转化 8
2.2.9 利用与农杆菌AGL-1共培养的方法进行大丽轮枝菌的遗传转化 8
2.2.10 大丽轮枝菌阳性转化子中VdUGPU基因表达量的荧光定量筛选 9
2.2.11 用于培养表型分析的特殊碳源查氏培养基的制备 10
2.2.12 菌株培养菌落形态的培养和观察方法 10
3 结果与分析 10
3.1 VdUGPU基因沉默质粒的构建 10
3.2 筛选 VdUGPU 表达量显著下调的突变体及其体内VdUG *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
PU基因的表达量定量分析 12
3.3 不同碳源查氏培养基培养菌落的形态观察 13
全 文 总 结 17
致 谢 18
参 考 文 献 19
1 绪论
1.1 棉花黄萎病的研究现状
1.1.1 棉花黄萎病的发现、分布及其危害
棉花黄萎病（Cotton Verticillium Wilt, CVW）是棉花上重要的土传病害，属维管束系统性病害，给棉花生产造成了严重的影响（喻树迅和范术丽 2003）。棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae Kleb.）可侵染多种农作物（Johnson et al. 1980; Emilie et al. 2006）。自发现棉花黄萎病以来，黄萎病不仅蔓延至整个美国棉花栽培区，也在世界各主要产棉区相继发现[1,2]。目前，棉花黄萎病在亚洲、欧洲、澳洲、拉丁美洲、非洲等 30 多个国家和地区均有分布（Pegg 1984; Blance 1989; 沈其益，1992）。
棉花黄萎病是世界各国棉花产区的重要土传维管束萎蔫病害，该病原菌分布范围广，可浸染一年生、多年生双子叶植物及单子叶植物，寄主多达 600 多种，一旦爆发造成严重经济损失[3,4]。棉花黄萎病是世界棉区的主要土传病害,在我国各产棉区危害日益加重，据统计2002年我国黄萎病发病面积高达300万hm2，已成为制约我国棉花产业发展的瓶颈问题[5]。黄萎病是棉花产生连作障碍的主要病害之一,其病原菌为土壤习居菌大丽轮枝菌，该病害的防治方法已成为棉花生产的研究热点[6]。生物防治是目前研究克服土传病害的重要方法之一,获得高效拮抗菌株是进行生物防治研究的基础[7,8]。
1.1.2 棉花黄萎病的发病症状
棉花黄萎病俗称“金边黄”，是由真菌中的半知菌引起的，能在棉籽、病株残体和土壤中越冬，并能长期在土中存活6 ～ 8年[9]。调运、土壤粪肥、种子传病主要在棉花苗期从根系侵入危害棉株输导组织，使维管束受害变褐色，同时由于水分、养分的输送受阻表现出萎蔫状，甚至枯死。自然条件下幼苗发病少或很少出现症状，一般在3～5片真叶期开始显症，生长中后期棉花现蕾后田间大量发病，初在植株下部叶片上的叶缘和叶脉间出现浅黄色斑块，后逐渐扩展，叶色失绿变浅，主脉及其四周仍保持绿色，病叶出现掌状斑驳，叶肉变厚，叶缘向下卷曲，叶片由下而上逐渐脱落，仅剩顶部少数小叶，蕾铃稀少，棉铃提前开裂，后期病株基部生出细小新枝。纵剖病茎，木质部上产生浅褐色变色条纹[10]。夏季暴雨后出现急性型萎蔫症状，棉株突然萎垂，叶片大量脱落，发病严重地块惨不忍睹，造成严重减产[11]。黄萎病发生轻重关键取决于气候因素，发病的最适宜气温为25℃~28℃，低于25℃或高于30℃发展缓慢，35℃以上有退隐现象。因此，雨水偏多、温度偏低的年份发病重。
1.1.3 棉花黄萎病的防治措施
选用抗病品种，同时有条件的采用轮作倒茬。及时破除地膜，加强中耕。在六月中旬前视天气变化情况及时破地膜，促根系下扎，同时加强中耕，降低 土壤湿度，及时排灌，增强棉株自身的抵抗能力[12]。合理整枝、及时化控。采取适时早打顶，同时将整枝打杈的枝叶和病株残体及时带出田外处理，控制病菌传播。据气候、苗情及时化控，增加棉株通风透光，改善棉田生态环境，抑制病菌蔓延[13]。增施 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
磷钾肥，防早衰。减少棉田氮肥的施用量，增施棉花专用微生物缓释肥，喷洒植物营养调节剂，提高棉花抗病性。化学防治，提倡早防，对轻病区棉田选用生物制剂，如益微加黄腐酸盐，5d喷 1次，连喷 2 次 。对重病区选用 2．5％克黄枯 、2．5％菌毒清 、 23％络铵铜等 250倍液灌根，7d喷1次 ，连灌 2 次。如果整株发病较重，要拔除并集中深埋，减少菌原再侵染。
1.2 大丽轮枝菌的研究现状
大丽轮枝菌入侵寄主后，其分生孢子大量生长会阻碍植物木质部对营养物质的运输[14]，同时病原真菌会产生水解酶和毒素等物质作用于寄主，最终导致植株死亡[15-16]。大丽轮枝菌糖代谢对于病原真菌的发育至关重要，快速筛选大丽轮枝菌糖代谢相关的致病基因，可以为防治由该菌引起的植物黄萎病提供理论依据[17]。随着大丽轮枝菌全基因组序列信息的公开，探究其致病相关基因的功能日益得到研究者重视。伴随众多大丽轮枝菌突变体的出现，病原真菌致病相关基因及功能、相关代谢通路也逐渐被揭示[18]。
1.3 课题研究的目的及意义
随着大丽轮枝菌全基因组序列信息的公开，探究其致病相关基因的功能日益得到研究者的重视。越来越多的大丽轮枝菌突变体的出现，使得更多的致病相关基因被揭示。而这些致病相关基因的发掘，及其调控侵染的分子机理的揭示，或许可以为将来防控大丽轮枝菌提供有效位点和策略。在前期研究中，我们在大丽轮枝菌中发现并鉴定了一个致病相关基因VdUGPU，该基因突变体表现为致病力显著降低。为了更进一步的证实该基因的表达与致病性的相关性，及其对大丽轮枝菌生长的作用，我们进行了本次实验。大丽轮枝菌是一种土传病原真菌，目前尚未研发出高抗黄萎病的棉花品种，也没有有效的抗病农药。所以，关于大丽轮枝菌致病相关基因的功能研究和致病相关因子的研究，对于棉花抗病分子育种有着重要意义。
6)融化固体LB培养基，半冷至不烫手加入合适的抗生素，倒平板，冷却，涂菌液，正面放置10 min；
建议采用两步法PCR反应程序。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。
1 绪论 1
1.1 棉花黄萎病的研究现状 1
1.1.1 棉花黄萎病的发现、分布及其危害 1
1.1.2 棉花黄萎病的发病症状 1
1.1.3 棉花黄萎病的防治措施 2
1.2 大丽轮枝菌的研究现状 2
1.3 课题研究的目的及意义 2
2 实验材料、试剂和方法 3
2.1 实验的相关试剂及配置 3
2.1.1 常用培养基的配置 3
2.1.2 抗生素的配置及使用浓度 4
2.2 实验步骤和方法 4
2.2.1 大丽轮枝菌总RNA的提取 4
2.2.2 cDNA反转录实验 5
2.2.3 质粒提取 6
2.2.4 1300-HYG-PS质粒酶切 6
2.2.5 VdUGPU片段无缝连接至1300-HYG-PS质粒 7
2.2.6 大肠杆菌的转化 7
2.2.7 对转化长出的菌落或提取的质粒进行PCR验证 7
2.2.8 农杆菌AGL-1的转化 8
2.2.9 利用与农杆菌AGL-1共培养的方法进行大丽轮枝菌的遗传转化 8
2.2.10 大丽轮枝菌阳性转化子中VdUGPU基因表达量的荧光定量筛选 9
2.2.11 用于培养表型分析的特殊碳源查氏培养基的制备 10
2.2.12 菌株培养菌落形态的培养和观察方法 10
3 结果与分析 10
3.1 VdUGPU基因沉默质粒的构建 10
3.2 筛选 VdUGPU 表达量显著下调的突变体及其体内VdUG *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
PU基因的表达量定量分析 12
3.3 不同碳源查氏培养基培养菌落的形态观察 13
全 文 总 结 17
致 谢 18
参 考 文 献 19
1 绪论
1.1 棉花黄萎病的研究现状
1.1.1 棉花黄萎病的发现、分布及其危害
棉花黄萎病（Cotton Verticillium Wilt, CVW）是棉花上重要的土传病害，属维管束系统性病害，给棉花生产造成了严重的影响（喻树迅和范术丽 2003）。棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae Kleb.）可侵染多种农作物（Johnson et al. 1980; Emilie et al. 2006）。自发现棉花黄萎病以来，黄萎病不仅蔓延至整个美国棉花栽培区，也在世界各主要产棉区相继发现[1,2]。目前，棉花黄萎病在亚洲、欧洲、澳洲、拉丁美洲、非洲等 30 多个国家和地区均有分布（Pegg 1984; Blance 1989; 沈其益，1992）。
棉花黄萎病是世界各国棉花产区的重要土传维管束萎蔫病害，该病原菌分布范围广，可浸染一年生、多年生双子叶植物及单子叶植物，寄主多达 600 多种，一旦爆发造成严重经济损失[3,4]。棉花黄萎病是世界棉区的主要土传病害,在我国各产棉区危害日益加重，据统计2002年我国黄萎病发病面积高达300万hm2，已成为制约我国棉花产业发展的瓶颈问题[5]。黄萎病是棉花产生连作障碍的主要病害之一,其病原菌为土壤习居菌大丽轮枝菌，该病害的防治方法已成为棉花生产的研究热点[6]。生物防治是目前研究克服土传病害的重要方法之一,获得高效拮抗菌株是进行生物防治研究的基础[7,8]。
1.1.2 棉花黄萎病的发病症状
棉花黄萎病俗称“金边黄”，是由真菌中的半知菌引起的，能在棉籽、病株残体和土壤中越冬，并能长期在土中存活6 ～ 8年[9]。调运、土壤粪肥、种子传病主要在棉花苗期从根系侵入危害棉株输导组织，使维管束受害变褐色，同时由于水分、养分的输送受阻表现出萎蔫状，甚至枯死。自然条件下幼苗发病少或很少出现症状，一般在3～5片真叶期开始显症，生长中后期棉花现蕾后田间大量发病，初在植株下部叶片上的叶缘和叶脉间出现浅黄色斑块，后逐渐扩展，叶色失绿变浅，主脉及其四周仍保持绿色，病叶出现掌状斑驳，叶肉变厚，叶缘向下卷曲，叶片由下而上逐渐脱落，仅剩顶部少数小叶，蕾铃稀少，棉铃提前开裂，后期病株基部生出细小新枝。纵剖病茎，木质部上产生浅褐色变色条纹[10]。夏季暴雨后出现急性型萎蔫症状，棉株突然萎垂，叶片大量脱落，发病严重地块惨不忍睹，造成严重减产[11]。黄萎病发生轻重关键取决于气候因素，发病的最适宜气温为25℃~28℃，低于25℃或高于30℃发展缓慢，35℃以上有退隐现象。因此，雨水偏多、温度偏低的年份发病重。
1.1.3 棉花黄萎病的防治措施
选用抗病品种，同时有条件的采用轮作倒茬。及时破除地膜，加强中耕。在六月中旬前视天气变化情况及时破地膜，促根系下扎，同时加强中耕，降低 土壤湿度，及时排灌，增强棉株自身的抵抗能力[12]。合理整枝、及时化控。采取适时早打顶，同时将整枝打杈的枝叶和病株残体及时带出田外处理，控制病菌传播。据气候、苗情及时化控，增加棉株通风透光，改善棉田生态环境，抑制病菌蔓延[13]。增施 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
磷钾肥，防早衰。减少棉田氮肥的施用量，增施棉花专用微生物缓释肥，喷洒植物营养调节剂，提高棉花抗病性。化学防治，提倡早防，对轻病区棉田选用生物制剂，如益微加黄腐酸盐，5d喷 1次，连喷 2 次 。对重病区选用 2．5％克黄枯 、2．5％菌毒清 、 23％络铵铜等 250倍液灌根，7d喷1次 ，连灌 2 次。如果整株发病较重，要拔除并集中深埋，减少菌原再侵染。
1.2 大丽轮枝菌的研究现状
大丽轮枝菌入侵寄主后，其分生孢子大量生长会阻碍植物木质部对营养物质的运输[14]，同时病原真菌会产生水解酶和毒素等物质作用于寄主，最终导致植株死亡[15-16]。大丽轮枝菌糖代谢对于病原真菌的发育至关重要，快速筛选大丽轮枝菌糖代谢相关的致病基因，可以为防治由该菌引起的植物黄萎病提供理论依据[17]。随着大丽轮枝菌全基因组序列信息的公开，探究其致病相关基因的功能日益得到研究者重视。伴随众多大丽轮枝菌突变体的出现，病原真菌致病相关基因及功能、相关代谢通路也逐渐被揭示[18]。
1.3 课题研究的目的及意义
随着大丽轮枝菌全基因组序列信息的公开，探究其致病相关基因的功能日益得到研究者的重视。越来越多的大丽轮枝菌突变体的出现，使得更多的致病相关基因被揭示。而这些致病相关基因的发掘，及其调控侵染的分子机理的揭示，或许可以为将来防控大丽轮枝菌提供有效位点和策略。在前期研究中，我们在大丽轮枝菌中发现并鉴定了一个致病相关基因VdUGPU，该基因突变体表现为致病力显著降低。为了更进一步的证实该基因的表达与致病性的相关性，及其对大丽轮枝菌生长的作用，我们进行了本次实验。大丽轮枝菌是一种土传病原真菌，目前尚未研发出高抗黄萎病的棉花品种，也没有有效的抗病农药。所以，关于大丽轮枝菌致病相关基因的功能研究和致病相关因子的研究，对于棉花抗病分子育种有着重要意义。
6)融化固体LB培养基，半冷至不烫手加入合适的抗生素，倒平板，冷却，涂菌液，正面放置10 min；
建议采用两步法PCR反应程序。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。
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