灵芝多胺代谢相关酶基因的克隆及突变菌株构建
灵芝是著名的药用真菌，具有多种生物学活性。多胺（Polyamine，PAs）是一类小分子脂肪族含氮碱，其合成代谢对促进细胞增殖、分化，维持细胞生理稳定具有重要作用。鸟氨酸脱羧酶（Ornithine Decarboxylase，ODC）、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（S-adenosyl methionine Decarboxylase，SAMDC）、亚精胺合成酶（Spermidine synthetase，SPDS）与精胺合成酶（Spermine synthetase，SPMS）是灵芝多胺合成途径中的几个关键酶。本实验以灵芝cDNA为模板，采用PCR扩增技术，克隆获得灵芝多胺合成代谢关键酶基因。将基因片段与T载体相连，转入大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并进行酶切鉴定，测序后挑菌培养，用碱裂解法提取质粒并将回收的酶切片段与pmi基因沉默载体连接，构建沉默转化子。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1实验材料与仪器4
1.2 实验方法 4
1.2.1 克隆酶基因4
1.2.2 质粒转化与提取5
1.2.3 构建沉默转化子5
1.2.4脂质体转化5
2 结果分析6
2.1酶基因克隆结果分析6
2.2脂质体转化结果分析8
3 讨论 9
致谢9
参考文献9
附录110
附录211
灵芝多胺代谢相关酶基因的克隆及突变菌株构建
生命科学与技术基地班 张小雨
引言
多胺 (Polyamine，PAs) 是一类存在于原核生物及真核生物中的具有强生物活性的低分子脂肪族含氮碱，其合成代谢与细胞的增殖和分化密切相关，参与多种生理过程，在促进细胞分化、增殖，维持细胞膜、DNA和RNA的稳定，以及生理应激方面发挥重要作用。主要包括腐胺（putrescine）、亚精胺（spermidine）、精胺（spermine）和尸胺（cadaverine）。
目前，多胺的主 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
要代谢和调节途径已基本揭示[1]，与植物多胺生物合成相关的酶的基因相继被克隆，并且获得了一些转基因植物[2]，同时也得到了一些多胺合成突变体。但关于灵芝中多胺代谢的研究相对较少，本实验旨在通过克隆灵芝多胺代谢相关酶的基因，并对其基因进行沉默，使人们能更深入地了解了多胺及其代谢相关酶在灵芝生长发育等生理过程中的重要作用。
在大部分的生物体内，多胺的合成始于腐胺的合成，主要通过鸟氨酸或其他中间体的直接脱羧反应来完成。在真菌和细菌等微生物体内存在两条合成腐胺的通路，前体分别是L鸟氨酸和 L精氨酸[3]。前者L鸟氨酸在鸟氨酸脱羧酶（Ornithine Decarboxylase，ODC）催化下脱羧生成腐胺，后者L精氨酸在精氨酸脱羧酶作用下脱羧形成胍丁胺，进而在胍丁胺脱氨酶作用下经过一系列变化生成腐胺[4]。腐胺在亚精胺合成酶（Spermidine synthetase，SPDS）的作用下接受氨丙基生成亚精胺，亚精胺在精胺合成酶（Spermine synthetase，SPMS）的作用下接受氨丙基生成精胺。同时，微生物体内还存在另一条途径来影响亚精胺和精胺的合成，S腺苷甲硫氨酸合酶能够将甲硫氨酸转换成 S腺苷甲硫氨酸（Sadenosyl methionine，SAM），SAM在SAM脱羧酶（Sadenosyl methionine Decarboxylase，SAMDC）作用下脱去羧基变为脱羧SAM，为多胺的生成提供氨丙基。脱羧SAM是亚精胺和精胺合成辅助因子，能够在亚精胺合酶和精胺合酶作用下合成亚精胺和精胺。
多胺的分解代谢是通过二胺氧化酶（Diamine oxidase，DAO) 和多胺氧化酶（Polyamine oxidase，PAO）的氧化作用实现的。二胺氧化酶是一类含铜酶，催化二胺腐胺和尸胺氧化分解，它催化腐胺生成 4氨基正丁醛、H2O2和氨。DAO在双子叶植物中含量水平较高，但至今仅在少数几个物种中发现其编码基因[5]。与DAO不同，PAO以非共价键与FAD相连，在单子叶植物中有较高的水平[6]。PAO有多个家族，它们的作用或是氧化多胺生成代谢终产物，或是催化多胺合成的逆反应。第1类PAO，如小麦PAO，催化亚精胺和精胺氧化分解分别生成4氨基正丁醛或3氨丙基4氨基正丁醛，同时生成1,3丙二胺和H2O2[7]。第2类PAO，如拟南芥PAO1和PAO4，类似于哺乳动物精胺氧化酶，催化精胺生成亚精胺，拟南芥PAO3可以催化精胺生成亚精胺，再生成腐胺[7]。第3类PAO也具有相似的多胺氧化酶结构域，但并不催化多胺的脱氨基作用[7]。
从多胺的生物代谢途径中可以看出，鸟氨酸脱羧酶（ODC）、S腺苷蛋氨酸脱羧酶（SAMDC）、亚精胺合成酶（SPDS）、精胺合成酶（SPMS）等，都是生物体内多胺合成途径中的关键酶，关于这些酶的基因克隆及其沉默分析将有助于人们从分子水平上揭示多胺调控灵芝生长发育的本质，并可能通过转基因手段调控灵芝的生长发育。
1 材料与方法
1．1 实验材料与仪器
灵芝菌株G20由上海农科院提供，大肠杆菌DH5α、溶壁酶购自广东省微生物研究所，T vector、Taq DNA polymerase、限制酶、T4 DNA ligase购自大连Takara公司，Amp等抗生素均购自上海生工生物工程公司。灵芝cDNA模板，dNTP，Buffer，甘油，ddH2O，Solution I II III，酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），70%乙醇，无水乙醇，LB培养基，CYM及上层培养基，5×TBE电泳缓冲液，TE缓冲液，RNase，分子量Maker等。
Eppendorfrealplex2荧光定量PCR仪，ABI 2720 型 PCR仪、DYY10C 型电泳仪、离心机，离心管，PCR管，超净台，移液枪及枪头，恒温培养箱，摇床，培养皿等。
1．2 实验方法
1．2．1 克隆酶基因 （1）根据NCBI获取鸟氨酸脱羧酶、S腺苷甲硫氨酸脱羧酶和亚精胺合成酶，以及精胺合成酶的蛋白序列，在灵芝EST数据库中比对出相应基因序列，分别为GL17083R1、GL17796R1和GL22111R1（实验室前期实验中，通过对灵芝平板生长菌丝进行热激并立刻提取RNA，反转成cDNA验证与多胺相关基因的表达量中，精胺和亚精胺合成酶基因，只有GL22111R1响应剧烈，故本实验先选取GL22111R1研究），在灵芝基因组数据库中找出基因全长，再通过NCBI比对，去除内含子，获得cDNA片段。通过primer软件分别设计基因全长和cDNA片段的引物。（2）以灵芝菌丝提取RNA反转录的cDNA为模板，PCR扩增GL17083R1和GL22111R1的基因全长，以及GL17083R1、GL22111R1和GL17796R1的cDNA片段，扩增产物取3μl进行1%的琼脂糖凝胶电泳,检测扩增结果。PCR体系25 μl：2.5 μl 10xBuffer，2 μl dNTPs，各1 μl 上、下游引物，1 μl 灵芝cDNA，17.3 μl ddH2O，0.2 μl Taq酶。扩增条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸3 min，30个循环；72℃延伸5min。全长PCR体系20 μl：各1 μl上、下游引物，7 μlddH2O，1 μlcDNA，10 μl prime star Max
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1实验材料与仪器4
1.2 实验方法 4
1.2.1 克隆酶基因4
1.2.2 质粒转化与提取5
1.2.3 构建沉默转化子5
1.2.4脂质体转化5
2 结果分析6
2.1酶基因克隆结果分析6
2.2脂质体转化结果分析8
3 讨论 9
致谢9
参考文献9
附录110
附录211
灵芝多胺代谢相关酶基因的克隆及突变菌株构建
生命科学与技术基地班 张小雨
引言
多胺 (Polyamine，PAs) 是一类存在于原核生物及真核生物中的具有强生物活性的低分子脂肪族含氮碱，其合成代谢与细胞的增殖和分化密切相关，参与多种生理过程，在促进细胞分化、增殖，维持细胞膜、DNA和RNA的稳定，以及生理应激方面发挥重要作用。主要包括腐胺（putrescine）、亚精胺（spermidine）、精胺（spermine）和尸胺（cadaverine）。
目前，多胺的主 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
要代谢和调节途径已基本揭示[1]，与植物多胺生物合成相关的酶的基因相继被克隆，并且获得了一些转基因植物[2]，同时也得到了一些多胺合成突变体。但关于灵芝中多胺代谢的研究相对较少，本实验旨在通过克隆灵芝多胺代谢相关酶的基因，并对其基因进行沉默，使人们能更深入地了解了多胺及其代谢相关酶在灵芝生长发育等生理过程中的重要作用。
在大部分的生物体内，多胺的合成始于腐胺的合成，主要通过鸟氨酸或其他中间体的直接脱羧反应来完成。在真菌和细菌等微生物体内存在两条合成腐胺的通路，前体分别是L鸟氨酸和 L精氨酸[3]。前者L鸟氨酸在鸟氨酸脱羧酶（Ornithine Decarboxylase，ODC）催化下脱羧生成腐胺，后者L精氨酸在精氨酸脱羧酶作用下脱羧形成胍丁胺，进而在胍丁胺脱氨酶作用下经过一系列变化生成腐胺[4]。腐胺在亚精胺合成酶（Spermidine synthetase，SPDS）的作用下接受氨丙基生成亚精胺，亚精胺在精胺合成酶（Spermine synthetase，SPMS）的作用下接受氨丙基生成精胺。同时，微生物体内还存在另一条途径来影响亚精胺和精胺的合成，S腺苷甲硫氨酸合酶能够将甲硫氨酸转换成 S腺苷甲硫氨酸（Sadenosyl methionine，SAM），SAM在SAM脱羧酶（Sadenosyl methionine Decarboxylase，SAMDC）作用下脱去羧基变为脱羧SAM，为多胺的生成提供氨丙基。脱羧SAM是亚精胺和精胺合成辅助因子，能够在亚精胺合酶和精胺合酶作用下合成亚精胺和精胺。
多胺的分解代谢是通过二胺氧化酶（Diamine oxidase，DAO) 和多胺氧化酶（Polyamine oxidase，PAO）的氧化作用实现的。二胺氧化酶是一类含铜酶，催化二胺腐胺和尸胺氧化分解，它催化腐胺生成 4氨基正丁醛、H2O2和氨。DAO在双子叶植物中含量水平较高，但至今仅在少数几个物种中发现其编码基因[5]。与DAO不同，PAO以非共价键与FAD相连，在单子叶植物中有较高的水平[6]。PAO有多个家族，它们的作用或是氧化多胺生成代谢终产物，或是催化多胺合成的逆反应。第1类PAO，如小麦PAO，催化亚精胺和精胺氧化分解分别生成4氨基正丁醛或3氨丙基4氨基正丁醛，同时生成1,3丙二胺和H2O2[7]。第2类PAO，如拟南芥PAO1和PAO4，类似于哺乳动物精胺氧化酶，催化精胺生成亚精胺，拟南芥PAO3可以催化精胺生成亚精胺，再生成腐胺[7]。第3类PAO也具有相似的多胺氧化酶结构域，但并不催化多胺的脱氨基作用[7]。
从多胺的生物代谢途径中可以看出，鸟氨酸脱羧酶（ODC）、S腺苷蛋氨酸脱羧酶（SAMDC）、亚精胺合成酶（SPDS）、精胺合成酶（SPMS）等，都是生物体内多胺合成途径中的关键酶，关于这些酶的基因克隆及其沉默分析将有助于人们从分子水平上揭示多胺调控灵芝生长发育的本质，并可能通过转基因手段调控灵芝的生长发育。
1 材料与方法
1．1 实验材料与仪器
灵芝菌株G20由上海农科院提供，大肠杆菌DH5α、溶壁酶购自广东省微生物研究所，T vector、Taq DNA polymerase、限制酶、T4 DNA ligase购自大连Takara公司，Amp等抗生素均购自上海生工生物工程公司。灵芝cDNA模板，dNTP，Buffer，甘油，ddH2O，Solution I II III，酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），70%乙醇，无水乙醇，LB培养基，CYM及上层培养基，5×TBE电泳缓冲液，TE缓冲液，RNase，分子量Maker等。
Eppendorfrealplex2荧光定量PCR仪，ABI 2720 型 PCR仪、DYY10C 型电泳仪、离心机，离心管，PCR管，超净台，移液枪及枪头，恒温培养箱，摇床，培养皿等。
1．2 实验方法
1．2．1 克隆酶基因 （1）根据NCBI获取鸟氨酸脱羧酶、S腺苷甲硫氨酸脱羧酶和亚精胺合成酶，以及精胺合成酶的蛋白序列，在灵芝EST数据库中比对出相应基因序列，分别为GL17083R1、GL17796R1和GL22111R1（实验室前期实验中，通过对灵芝平板生长菌丝进行热激并立刻提取RNA，反转成cDNA验证与多胺相关基因的表达量中，精胺和亚精胺合成酶基因，只有GL22111R1响应剧烈，故本实验先选取GL22111R1研究），在灵芝基因组数据库中找出基因全长，再通过NCBI比对，去除内含子，获得cDNA片段。通过primer软件分别设计基因全长和cDNA片段的引物。（2）以灵芝菌丝提取RNA反转录的cDNA为模板，PCR扩增GL17083R1和GL22111R1的基因全长，以及GL17083R1、GL22111R1和GL17796R1的cDNA片段，扩增产物取3μl进行1%的琼脂糖凝胶电泳,检测扩增结果。PCR体系25 μl：2.5 μl 10xBuffer，2 μl dNTPs，各1 μl 上、下游引物，1 μl 灵芝cDNA，17.3 μl ddH2O，0.2 μl Taq酶。扩增条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸3 min，30个循环；72℃延伸5min。全长PCR体系20 μl：各1 μl上、下游引物，7 μlddH2O，1 μlcDNA，10 μl prime star Max
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