拟南芥npc3细胞定位拟南芥npc3细胞定位和耐高铵胁迫的初步研究(附件)【字数：9714】
磷脂酶C（phospholipase C, PLC）是一类重要的磷脂水解酶，依据其水解底物的特异性，可以分为非特异性磷脂酶C（non-specific PLC, NPC）和磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（phosphoinositide-specific PLC, PI-PLC）。NPC催化磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）等初级膜磷脂水解，生成二酰基甘油（diacylglycerol，DAG）和磷酸基团的头部分子。在拟南芥中，NPC蛋白家族由6个基因编码，分别命名为NPC1-NPC6，它们在植物脂代谢和信号传递中发挥了多种生理作用。NPC3基因大小为2841bp，已有研究表明拟南芥NPC3可能参与生长素信号过程。本实验利用生理、细胞和分子遗传等多种手段，揭示在外界胁迫下，NPC3如何调节生长素的作用并参与抗胁迫作用。本实验利用绿色荧光蛋白（GFP）技术和GUS技术探究NPC3的细胞表达定位。实验结果表明，NPC3在拟南芥根部大量表达。利用(NH4)2SO4处理拟南芥野生型和npc3突变体幼苗，探究NPC3对拟南芥耐高铵胁迫的影响。在铵毒处理下，与野生型相比，npc3突变体根长显著变短，暗示NPC3可能正调控植物的耐高铵过程。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法5
实验材料 5
1.1.1 拟南芥遗传材料5
1.1.2 实验载体与菌株5
1.1.3 实验试剂5
1.1.4 主要实验仪器5
1.1.5 实验常用培养基5
1.2 实验方法 6
1.2.1 拟南芥RNA的提取6
1.2.2 RNA的反转录6
1.2.3 目的基因的克隆7
1.2.4 PCR产物核酸电泳及胶回收7
1.2.5 GFP重组质粒与GUS重组质粒的构建8
1.2.6 大肠杆菌热激转化9
1.2.7 碱裂解法提取质粒9
1.2.8农杆菌侵染法构建转基因植株10
1.2.9 GUS染色10
1.2.10 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
铵毒处理拟南芥幼苗10
2 结果与分析10
2.1 NPC3基因分析11
2.2 重组质粒的构建11
2.3 蛋白水平上NPC3蛋白的表达分析11
2.3.1 GFP组织表达定位分析11
2.3.2 GUS组织表达定位分析12
2.4 npc3突变体与野生型（WT）耐高铵胁迫分析12
3 讨论 13
3.1 NPC3组织定位与其功能关系13
3.2 NPC3参与植物高铵胁迫的耐性调控13
3.3 关于NPC3功能和分子机制的未来展望13
致谢13
参考文献14
拟南芥NPC3细胞定位和耐高铵胁迫的初步研究
引言
引言
磷脂是细胞膜的主要组成部分，参与感受、应答细胞外刺激和胁迫。在高等动植物体内的各种信号转导途径中，磷脂的代谢起到非常重的作用[12]，磷脂的水解反应广泛存在于生物和非生物胁迫环境中[3]。磷脂酶 (phospholipases) 是催化磷脂水解的一种酶，并且普遍存在于各类细胞中。可根据磷脂酶切割磷脂位点的不同，将其分为4 大类 ：磷脂酶A1 (phospholipase A1, PLA1)、 磷脂酶A2 (phospholipase A2,PLA2)、磷脂酶C (phospholipase C,PLC)和磷脂酶D(phospholipase D,PLD)[4]。4类磷脂酶中，磷脂酶C介导的细胞信号通路是信号转导中最经典的通路之一[5]。依据底物的选择特异性，植物中的磷脂酶C又可分为磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（PIPLC，磷脂酰肌醇作为底物）和非特异性磷脂酶C（Nonspecific phospholipase C，NPC）。与PIPLC选择性地以磷脂酰肌醇为底物所区别的是，NPC可以利用不同的磷脂作为底物，如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰丝氨酸，产生sn1，2二酰基甘油(DAG)和相应的磷酸酯组。
现阶段研究看来，人们对动植物中PIPLC的生化特征、蛋白功能和信号传导等研究较为清楚。但植物NPCs如何应答外界刺激并调控细胞应答，及其可能的分子机理，却知之较少。与PIPLC相比，NPC蛋白有着截然不同的生化特征。例如，NPC不水解PIP2，而是以PC、PE和lysoPA等脂类为底物[6]；并且其活性不依赖于钙离子[78]。因此，可能NPC参与调控的信号过程与生物功能与PIPLC截然不同。
拟南芥NPC基因家族由6个亚型组成，分别是NPC1、NPC2、NPC3、NPC4、NPC5和NPC 6。它们的编码蛋白由514～538个氨基酸残基组成，分子量在60kD左右[9]。NPC4被发现是一种质膜结合蛋白[6、10]。NPC4和NPC5可以水解PC [11]。NPC3是一种具有溶血磷脂酸性磷酸酶活性而不是PLC活性的酶[8]。最近的研究表明，NPC作为植物代谢的中介物质在磷脂二半乳糖基 DAG交换方面[6、11]，和与激素信号传递有关的生长和发育方面[1213]，以及对不断变化的环境条件胁迫的应对[1418]等方面发挥了重要作用。
在组织表达水平，拟南芥NPC3和NPC4 在根尖强烈表达，NPC5在花器官表达量较高；NPC2和NPC6在荚果表达量高，NPC1在各组织均有较高表达[7]。
从结构上来看，NPC1和NPC2分别定位于拟南芥的1号染色体和2号染色体上，NPC 3、NPC 4和NPC 5则以串联排列的方式定位在拟南芥3号染色体上。这6个NPC的氨基酸水平同源性在52.8％~84.7％之间[12]。NPC蛋白含有一个中央磷酸酯酶结构域，该结构域通常存在于具有酯酶活性的酶中。一般来说，植物NPCs具有很高的相似性，特别是在磷酸酯酶结构域（图1）。大多数植物NPCs在N端含有一个信号肽，随后是一个短的可变区和一个高度保守的结构域。拟南芥NPC 3、NPC 4和NPC 5中缺失信号肽[19]。
图1 拟南芥NPC与已知铜绿假单胞菌和结核分枝杆菌NPCs的原理图比对[20]以及与F.tularensis酸性磷酸酶对比[21]
生长素参与植物生长、发育和逆境响应等重要过程。生长素的跨细胞转运需要质膜定位的输出和输入载体蛋白，主要分为三种类型：生长素输入蛋白AUX1/LAXs（AUXINRESISTANT1/AUX1LIKEs），生长素输出蛋白 PINs（PINFORMEDs）和 ABCB/PGP 蛋白（ATPbindingcassette B/Pglycoprotein）[22]。其中，大部分PINs蛋白在质膜极性分布，该特征决定了生长素的极性运输方向、分布[23]。拟南芥基因组有8个基因编码PIN蛋白，其中PIN4蛋白在根柱细胞表达较强 [23]。另一方面，PINs蛋白极性分布、活性受其磷酸化水平所调控[23]。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法5
实验材料 5
1.1.1 拟南芥遗传材料5
1.1.2 实验载体与菌株5
1.1.3 实验试剂5
1.1.4 主要实验仪器5
1.1.5 实验常用培养基5
1.2 实验方法 6
1.2.1 拟南芥RNA的提取6
1.2.2 RNA的反转录6
1.2.3 目的基因的克隆7
1.2.4 PCR产物核酸电泳及胶回收7
1.2.5 GFP重组质粒与GUS重组质粒的构建8
1.2.6 大肠杆菌热激转化9
1.2.7 碱裂解法提取质粒9
1.2.8农杆菌侵染法构建转基因植株10
1.2.9 GUS染色10
1.2.10 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
铵毒处理拟南芥幼苗10
2 结果与分析10
2.1 NPC3基因分析11
2.2 重组质粒的构建11
2.3 蛋白水平上NPC3蛋白的表达分析11
2.3.1 GFP组织表达定位分析11
2.3.2 GUS组织表达定位分析12
2.4 npc3突变体与野生型（WT）耐高铵胁迫分析12
3 讨论 13
3.1 NPC3组织定位与其功能关系13
3.2 NPC3参与植物高铵胁迫的耐性调控13
3.3 关于NPC3功能和分子机制的未来展望13
致谢13
参考文献14
拟南芥NPC3细胞定位和耐高铵胁迫的初步研究
引言
引言
磷脂是细胞膜的主要组成部分，参与感受、应答细胞外刺激和胁迫。在高等动植物体内的各种信号转导途径中，磷脂的代谢起到非常重的作用[12]，磷脂的水解反应广泛存在于生物和非生物胁迫环境中[3]。磷脂酶 (phospholipases) 是催化磷脂水解的一种酶，并且普遍存在于各类细胞中。可根据磷脂酶切割磷脂位点的不同，将其分为4 大类 ：磷脂酶A1 (phospholipase A1, PLA1)、 磷脂酶A2 (phospholipase A2,PLA2)、磷脂酶C (phospholipase C,PLC)和磷脂酶D(phospholipase D,PLD)[4]。4类磷脂酶中，磷脂酶C介导的细胞信号通路是信号转导中最经典的通路之一[5]。依据底物的选择特异性，植物中的磷脂酶C又可分为磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（PIPLC，磷脂酰肌醇作为底物）和非特异性磷脂酶C（Nonspecific phospholipase C，NPC）。与PIPLC选择性地以磷脂酰肌醇为底物所区别的是，NPC可以利用不同的磷脂作为底物，如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰丝氨酸，产生sn1，2二酰基甘油(DAG)和相应的磷酸酯组。
现阶段研究看来，人们对动植物中PIPLC的生化特征、蛋白功能和信号传导等研究较为清楚。但植物NPCs如何应答外界刺激并调控细胞应答，及其可能的分子机理，却知之较少。与PIPLC相比，NPC蛋白有着截然不同的生化特征。例如，NPC不水解PIP2，而是以PC、PE和lysoPA等脂类为底物[6]；并且其活性不依赖于钙离子[78]。因此，可能NPC参与调控的信号过程与生物功能与PIPLC截然不同。
拟南芥NPC基因家族由6个亚型组成，分别是NPC1、NPC2、NPC3、NPC4、NPC5和NPC 6。它们的编码蛋白由514～538个氨基酸残基组成，分子量在60kD左右[9]。NPC4被发现是一种质膜结合蛋白[6、10]。NPC4和NPC5可以水解PC [11]。NPC3是一种具有溶血磷脂酸性磷酸酶活性而不是PLC活性的酶[8]。最近的研究表明，NPC作为植物代谢的中介物质在磷脂二半乳糖基 DAG交换方面[6、11]，和与激素信号传递有关的生长和发育方面[1213]，以及对不断变化的环境条件胁迫的应对[1418]等方面发挥了重要作用。
在组织表达水平，拟南芥NPC3和NPC4 在根尖强烈表达，NPC5在花器官表达量较高；NPC2和NPC6在荚果表达量高，NPC1在各组织均有较高表达[7]。
从结构上来看，NPC1和NPC2分别定位于拟南芥的1号染色体和2号染色体上，NPC 3、NPC 4和NPC 5则以串联排列的方式定位在拟南芥3号染色体上。这6个NPC的氨基酸水平同源性在52.8％~84.7％之间[12]。NPC蛋白含有一个中央磷酸酯酶结构域，该结构域通常存在于具有酯酶活性的酶中。一般来说，植物NPCs具有很高的相似性，特别是在磷酸酯酶结构域（图1）。大多数植物NPCs在N端含有一个信号肽，随后是一个短的可变区和一个高度保守的结构域。拟南芥NPC 3、NPC 4和NPC 5中缺失信号肽[19]。
图1 拟南芥NPC与已知铜绿假单胞菌和结核分枝杆菌NPCs的原理图比对[20]以及与F.tularensis酸性磷酸酶对比[21]
生长素参与植物生长、发育和逆境响应等重要过程。生长素的跨细胞转运需要质膜定位的输出和输入载体蛋白，主要分为三种类型：生长素输入蛋白AUX1/LAXs（AUXINRESISTANT1/AUX1LIKEs），生长素输出蛋白 PINs（PINFORMEDs）和 ABCB/PGP 蛋白（ATPbindingcassette B/Pglycoprotein）[22]。其中，大部分PINs蛋白在质膜极性分布，该特征决定了生长素的极性运输方向、分布[23]。拟南芥基因组有8个基因编码PIN蛋白，其中PIN4蛋白在根柱细胞表达较强 [23]。另一方面，PINs蛋白极性分布、活性受其磷酸化水平所调控[23]。
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