放线菌源l半胱氨酸脱巯基酶的克隆和重组表达
：本研究以实验室分离得到的一株放线菌（编号A7Y）的半胱氨酸脱巯基酶为研究对象，利用PCR技术体外扩增其基因片段，得到约1.3kb大小的片段。构建了两种表达载体并尝试在不同的宿主中表达目的蛋白，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）检测目的蛋白表达情况，并以菌体破碎液上清为粗酶液测量其酶活，结果显示该酶在大肠杆菌中虽然能够表达，但以无活性的包涵体形式存在。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Keywords 3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1 菌株与质粒 4
1.2 酶和其他试剂 4
1.3 培养基 4
1.4 L半胱氨酸脱巯基酶在大肠杆菌中的重组表达 4
1.4.1 L半胱氨酸脱巯基酶基因的体外扩增 4
1.4.2 加A尾 5
1.4.3 酶连 5
1.4.4 大肠杆菌快速感受态细胞的制备 5
1.4.5 酶连产物的转化与阳性克隆的筛选 5
1.4.6 质粒DNA的小量提取及双酶切验证 5
1.4.7 序列测定 6
1.4.8 目的基因的Nde I/Xho I双酶切及纯化 6
1.4.9 pET29a(+)的Nde I/Xho I双酶切及纯化 6
1.4.10 表达载体1266 pET29a(+)的构建 6
1.4.11 1266 pET29a(+) 表达菌株的构建 6
1.4.12 1266 pET29a(+) 表达菌株对目的蛋白表达情况的检测 7
1.4.13 重组酶的活性检测 7
1.5 LCD基因在大肠杆菌中与谷胱甘肽S转移酶（GST）的融合表达 7
1.6 LCD基因在改造菌 E.coli Origami 2（DE3）Δ4中的重组表达 7
2 结果与分析 7
2.1 L半胱氨酸脱巯基酶基因的克隆，表达载体与表达菌株的构建 7
2.2 L半胱氨酸脱巯基酶在大肠杆菌中的表达情况与酶活检测 9<
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br /> 2.3 LCD基因在大肠杆菌中与谷胱甘肽S转移酶（GST）的融合表达 10
2.4 LCD基因在E.coli Origami 2 (DE3) Δ4中的重组表达 12
3 讨论 13
3.1 包涵体的产生原因 13
3.2 增加重组蛋白可溶性的策略 14
致谢 14
参考文献 14
放线菌源L半胱氨酸脱巯基酶的克隆和重组表达
引言
引言:L半胱氨酸脱巯基酶(Lcysteine desulfhydrase EC 4.4.1.1)[1]，在生物体内主要催化将L半胱氨酸分解为丙酮酸、H2S和NH3[2]的反应，分布广泛，迄今为止已经在包括大肠杆菌等多种生物中发现[3]。由于其反应涉及有机硫向无机硫的转化而引起了众多学者的兴趣，本文中提及的半胱氨酸脱巯基酶发现于一株放线菌中，目前在微生物领域对这一酶的研究主要集中于细菌，迄今为止半胱氨酸脱巯基酶已经被证明在许多领域有着重要作用，在工业发酵生产L半胱氨酸的过程中，微生物体内的L半胱氨酸脱巯基酶会使产物分解而降低产量[4]，Streptococcus属中的L半胱氨酸脱巯基酶催化产生的H2S则被认为与牙周脓肿有着一定关系[5]。同为常见口腔细菌的Fusobacterium nucleatum 其所含的L半胱氨酸脱巯基酶则被认为能够产生大量H2S从而引发口臭[6]。在我国，现阶段生产半胱氨酸主要依靠毛发水解，这种方式生产的半胱氨酸成分复杂，通常为D，L型半胱氨酸的混合物，且化学拆分造成的污染较大[7] 因此也有研究将L半胱氨酸脱巯基酶应用于D，L半胱氨酸的拆分，特异性分解L型而保留D型，后者是一种重要的医药中间体[8]。由于目前缺乏该酶在放线菌中的相关研究报道，因此对这株放线菌中的L半胱氨酸脱巯基酶进行研究能够拓宽对于该酶的认识，同时对于鉴于该酶在工业生产中的作用，这种研究对于实际生产也有一定现实意义。
本实验中构建表达载体所使用的质粒之一，pET42b（+）是一种大肠杆菌基因操作中常用载体，其中包含一段GST标签序列，这种标签除了在蛋白纯化过程中可以提供帮助外，有研究显示该标签能够提高与其融合表达的蛋白质在细胞质内的可溶性[9]。宿主菌株E.coli Origami 2（DE3）Δ4 是一种由本实验室在E.coli Origami 2（DE3）基础上构建的，通过敲除其编码rRNA的部分基因延缓其翻译过程，表现为生长极其缓慢。
1 材料与方法
1.1 菌株与质粒
E.coli DH5α 、E.coli BL21（DE3）、大肠杆菌质粒pET29a(+) ，pMD19T等 详见表1。
表1 供试菌株，质粒或引物
Table 1 Strains ，plasmids and primers used in this study
strain or plasmid
characteristic
Resource
strains
E.coli DH5α
Host strain for cloning vectors
Lab stock
E.coli BL21(DE3)
E.coli Origami 2（DE3）Δ4
plasmids
pET29a（+）
pET42b（+）
1266 pET 29a（+）
1266 pET 42b（+）
pMD19t
1266pMD19T
1266bpMD19T
primers
P1（Nde I site）
P2 (Xho I site)
P3 (Spe I site)
Host strain for expressing vectors
Host strain for expressin vactors
Expression vector, Kmr
Expression vector, Kmr with GST tag
pET29a（+） carrying gene of LCD
pET42b（+） carrying gene of LCD
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Keywords 3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1 菌株与质粒 4
1.2 酶和其他试剂 4
1.3 培养基 4
1.4 L半胱氨酸脱巯基酶在大肠杆菌中的重组表达 4
1.4.1 L半胱氨酸脱巯基酶基因的体外扩增 4
1.4.2 加A尾 5
1.4.3 酶连 5
1.4.4 大肠杆菌快速感受态细胞的制备 5
1.4.5 酶连产物的转化与阳性克隆的筛选 5
1.4.6 质粒DNA的小量提取及双酶切验证 5
1.4.7 序列测定 6
1.4.8 目的基因的Nde I/Xho I双酶切及纯化 6
1.4.9 pET29a(+)的Nde I/Xho I双酶切及纯化 6
1.4.10 表达载体1266 pET29a(+)的构建 6
1.4.11 1266 pET29a(+) 表达菌株的构建 6
1.4.12 1266 pET29a(+) 表达菌株对目的蛋白表达情况的检测 7
1.4.13 重组酶的活性检测 7
1.5 LCD基因在大肠杆菌中与谷胱甘肽S转移酶（GST）的融合表达 7
1.6 LCD基因在改造菌 E.coli Origami 2（DE3）Δ4中的重组表达 7
2 结果与分析 7
2.1 L半胱氨酸脱巯基酶基因的克隆，表达载体与表达菌株的构建 7
2.2 L半胱氨酸脱巯基酶在大肠杆菌中的表达情况与酶活检测 9<
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2.4 LCD基因在E.coli Origami 2 (DE3) Δ4中的重组表达 12
3 讨论 13
3.1 包涵体的产生原因 13
3.2 增加重组蛋白可溶性的策略 14
致谢 14
参考文献 14
放线菌源L半胱氨酸脱巯基酶的克隆和重组表达
引言
引言:L半胱氨酸脱巯基酶(Lcysteine desulfhydrase EC 4.4.1.1)[1]，在生物体内主要催化将L半胱氨酸分解为丙酮酸、H2S和NH3[2]的反应，分布广泛，迄今为止已经在包括大肠杆菌等多种生物中发现[3]。由于其反应涉及有机硫向无机硫的转化而引起了众多学者的兴趣，本文中提及的半胱氨酸脱巯基酶发现于一株放线菌中，目前在微生物领域对这一酶的研究主要集中于细菌，迄今为止半胱氨酸脱巯基酶已经被证明在许多领域有着重要作用，在工业发酵生产L半胱氨酸的过程中，微生物体内的L半胱氨酸脱巯基酶会使产物分解而降低产量[4]，Streptococcus属中的L半胱氨酸脱巯基酶催化产生的H2S则被认为与牙周脓肿有着一定关系[5]。同为常见口腔细菌的Fusobacterium nucleatum 其所含的L半胱氨酸脱巯基酶则被认为能够产生大量H2S从而引发口臭[6]。在我国，现阶段生产半胱氨酸主要依靠毛发水解，这种方式生产的半胱氨酸成分复杂，通常为D，L型半胱氨酸的混合物，且化学拆分造成的污染较大[7] 因此也有研究将L半胱氨酸脱巯基酶应用于D，L半胱氨酸的拆分，特异性分解L型而保留D型，后者是一种重要的医药中间体[8]。由于目前缺乏该酶在放线菌中的相关研究报道，因此对这株放线菌中的L半胱氨酸脱巯基酶进行研究能够拓宽对于该酶的认识，同时对于鉴于该酶在工业生产中的作用，这种研究对于实际生产也有一定现实意义。
本实验中构建表达载体所使用的质粒之一，pET42b（+）是一种大肠杆菌基因操作中常用载体，其中包含一段GST标签序列，这种标签除了在蛋白纯化过程中可以提供帮助外，有研究显示该标签能够提高与其融合表达的蛋白质在细胞质内的可溶性[9]。宿主菌株E.coli Origami 2（DE3）Δ4 是一种由本实验室在E.coli Origami 2（DE3）基础上构建的，通过敲除其编码rRNA的部分基因延缓其翻译过程，表现为生长极其缓慢。
1 材料与方法
1.1 菌株与质粒
E.coli DH5α 、E.coli BL21（DE3）、大肠杆菌质粒pET29a(+) ，pMD19T等 详见表1。
表1 供试菌株，质粒或引物
Table 1 Strains ，plasmids and primers used in this study
strain or plasmid
characteristic
Resource
strains
E.coli DH5α
Host strain for cloning vectors
Lab stock
E.coli BL21(DE3)
E.coli Origami 2（DE3）Δ4
plasmids
pET29a（+）
pET42b（+）
1266 pET 29a（+）
1266 pET 42b（+）
pMD19t
1266pMD19T
1266bpMD19T
primers
P1（Nde I site）
P2 (Xho I site)
P3 (Spe I site)
Host strain for expressing vectors
Host strain for expressin vactors
Expression vector, Kmr
Expression vector, Kmr with GST tag
pET29a（+） carrying gene of LCD
pET42b（+） carrying gene of LCD
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