施用有机肥对红壤氨氧化细菌多样性的影响
：红壤广泛的存在于我国南方，该地区也是重要的粮食和经济作物产区。但近年来，水土流失、土壤生物活性下降、肥力减退及环境污染等问题已严重影响红壤地区农业经济的可持续发展。土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，在土壤生态平衡、物质循环和植物养分转换等过程中起着重要的作用。本研究主要通过PCR扩增、基因克隆、RFLP和序列分析等对四种不同有机肥处理下氨氧化细菌中氨单加氧酶基因（amoA）的多样性和系统发育进行了分析。通过RFLP分析和多样性指数计算发现，四个文库的覆盖值都很高（90%以上），可以代表了环境中绝大部分的氨氧化细菌。四种文库中的amoA基因的多样性均匀性不高，但文库之间都存在着共同的主要类群，主要以亚硝化螺菌为主。四个文库群落之间相似性比较高（57%以上）。MPN计数结果显示随投加有机肥量的增加氨氧化细菌数量是逐渐增加的。因此说明向贫瘠的红壤中施加有机肥和改良红壤有利于增加氨氧化细菌数量，对氨氧化细菌群落种类多样性的影响不明显。这也与红壤环境下氨氧化细菌自身种类少有一定的关系。本课题的研究不仅有利于红壤地区作物产量的改善，同时也为新型氮肥的研制提供了新的思路。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
前言2
1 材料与方法2
1.1 实验试剂 2
1.2 样品采集、保存及理化性质4
1.3 土壤微生物总DNA提取方法4
1.4 土壤硝化细菌的MPN计数方法4
1.4.1 土壤氨氧化细菌的计数 5
1.4.2 土壤亚硝酸氧化细菌的计数5
1.4.3 硝化细菌培养基的配制5
1.5 amoA片段扩增、纯化5
1.6 普通感受态细胞的制备（CaCl2）6
1.7 PCR产物的TA克隆7
1.8 酶连产物的转化7
1.9 文库的检查与保存7
1.10 文库克隆的酶切分析8
1.10.1 菌落PCR扩增转化子的插入片段8
1.10.2 文库amoA扩增片段的限制性内切酶酶切(RFLP)8
1.10.3 酶切产物的电泳分析8<
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
br /> 1.11 amoA文库的统计分析9
1.11.1 文库酶切类型归类分析9
1.11.2 群落结构多样性评价指数的计算方法9
1.12 序列测定和系统进化树构建10
2 结果与分析10
2.1 红壤微生物amoA文库的构建10
2.2 amoA基因文库酶切类型的统计分析11
2.3 四个amoA基因文库的库容分析11
2.4 amoA文库的多样性指数分析12
2.5 四种amoA文库之间群落相似性比较13
2.6 系统进化树的构建与系统发育分析13
3 讨论15
致谢15
参考文献16
施用有机肥对红壤氨氧化细菌多样性的影响
引言
前言：氮循环过程中许多氮的化合物都与一系列重大环境问题有关，地表氮循环的建立与氮循环的平衡中微生物起了主导作用。在地球生物圈的氮循环中，任何化合态的氮素的积累都会给整个循环带来严重的威胁。硝化作用在氮素循环中扮演着重要角色。生物圈中各个生态系统的氮素循环一般通过生物固氮，以氨的形式输入氮素；经过同化、氨化、硝化、异化性硝酸盐还原等生物转化作用及其相伴的迁移运动；最终借助反硝化作用，以氮气的形式输出氮素。因此，硝化细菌在促进水域生态系统的氮循环、进而缓解环境压力、保持健康水产养殖环境中发挥着巨大作用。此外，硝化细菌作为单细胞微生物，还是环境变化的敏感指标，比大型动、植物更宜于指示环境状况的变化。硝化细菌生态学也成为了国际上研究热点。
氮素是作物的主要营养元素，它对于作物的产量和品质关系极大。由于绝大部分红壤中都缺氮，因此，各地施用氮肥都有明显的增产效果，氮肥已经成为世界上生产和施用量最大的化肥。1992年我国氮肥施用量达到19×106t（养分量），占化肥总量的80%，迄今为止，我国化肥施用量已居世界首位，是美国的6.9倍[1]。大量氮肥投加到土壤中，已引起很多的环境问题[2]。如硝酸盐的淋失对地下水的污染，大量不合理施肥对土壤及作物的污染，反硝化作用损失的氮对大气臭氧层的破坏及所流失的氮素等汇集于河流、湖泊而造成水体的富营养化等问题。在好气条件下，硝化细菌通过硝化作用在氮素的转移过程中也起到了重要的作用，但是对于硝化细菌群落发生变化的研究相对较少，传统的硝化细菌生态学研究主要是通过富集纯化培养，借助显微镜观察，根据细胞的形态构造和生理生化特点来进行，使得对硝化细菌生态学的研究基本停留在总体计数水平，很难为其可靠的种群结构研究和系统发育分析提供证据；另一方面，由于硝化细菌的生长非常缓慢(氨氧化菌生长周期为(8~24 h)，许多种难以培养或至今尚未分离得到纯菌株，从而影响了对这类微生物的深入研究。此外，分离培养的菌种并不能代表环境样品中的细菌多样性[3]，因此，用分离培养方法来研究硝化细菌往往不能正确反映自然环境样品的真实情况，所以我们采用未培养的方法从分子水平来认识硝化细菌的群落组成信息与土壤成分变化之间的关系。
1 材料与方法
1．1 实验试剂
大肠杆菌DH10B由本实验室保存；
尿素、丙三醇、去离子甲酰胺购自上海生工生物公司，TA克隆载体pMD18T Vector购自Takara公司；
dNTP、Taq DNA聚合酶、IPTG、Xgal购自上海Genbase公司；
氨苄青霉素购自南京赛吉公司；
大肠杆菌用LB培养基培养，氨苄青霉素(Amp)使用浓度为100 mg?l1；
溶菌酶、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）、SDS（十二烷基磺酸钠），DEPC (已二酸二已酯)，Trisbase（三羟甲基氨基甲烷）、酸性酚(pH5.2)、EDTA二钠盐等购自南京赛吉公司；
蛋白酶K为德国Merk公司产品；
焦磷酸钠购自上海化学试剂厂；
DS1高速组织捣碎机购自上海标本模型厂。
1．2 样品采集、保存及理化性质
实验采样的地点在湖南衡阳的中国农业科学院衡阳红壤实验站内。自行设计的养分淋溶试验小区，该小区位于湖南省衡阳中国农业科学院衡阳红壤实验站（东经116°55′30″，北纬28°15′20″），属于中亚热带湿润季风气候。试验用的大型排水采集器(lysimeter)为长2m×宽2 m的水泥池，为降低土壤原有机质的影响，选择荒地土壤作为供试土壤。
每年4月初至7月中旬在小区内种植玉米（山东登海一号），玉米收获后至次年4月休闲。试验使用养殖厂猪粪作为有机肥，设置四个处理，每个处理3个重复：1.CK，不施肥；2.LM，低量有机肥，150 kg N/hm2/a；3.HM，高量有机肥，600 kg N/hm2/a；4.ML，高量有机肥+石灰，600 kg N/hm2/a +石灰3000 kg/hm2/a。
采样时间在2014年7月下旬收获庄稼一周后，土壤样品均为五点混合样品，采样深度0 ~ 15 cm，在表层取样，每种土壤样品重约1kg。土壤采集后，用布袋封装，以增加样品的通气性。样品带回室内，除去根系、石块等杂物，过4 mm筛，保存在4℃冰箱中。取100 g土样，风干后用于理化性质测定；土壤含水量测定、微生物计数、土壤微生物活性测定等在1 ~ 2周内完成；另取一部分保存于70℃冰箱中用于土壤微生物总DNA提取。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
前言2
1 材料与方法2
1.1 实验试剂 2
1.2 样品采集、保存及理化性质4
1.3 土壤微生物总DNA提取方法4
1.4 土壤硝化细菌的MPN计数方法4
1.4.1 土壤氨氧化细菌的计数 5
1.4.2 土壤亚硝酸氧化细菌的计数5
1.4.3 硝化细菌培养基的配制5
1.5 amoA片段扩增、纯化5
1.6 普通感受态细胞的制备（CaCl2）6
1.7 PCR产物的TA克隆7
1.8 酶连产物的转化7
1.9 文库的检查与保存7
1.10 文库克隆的酶切分析8
1.10.1 菌落PCR扩增转化子的插入片段8
1.10.2 文库amoA扩增片段的限制性内切酶酶切(RFLP)8
1.10.3 酶切产物的电泳分析8<
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br /> 1.11 amoA文库的统计分析9
1.11.1 文库酶切类型归类分析9
1.11.2 群落结构多样性评价指数的计算方法9
1.12 序列测定和系统进化树构建10
2 结果与分析10
2.1 红壤微生物amoA文库的构建10
2.2 amoA基因文库酶切类型的统计分析11
2.3 四个amoA基因文库的库容分析11
2.4 amoA文库的多样性指数分析12
2.5 四种amoA文库之间群落相似性比较13
2.6 系统进化树的构建与系统发育分析13
3 讨论15
致谢15
参考文献16
施用有机肥对红壤氨氧化细菌多样性的影响
引言
前言：氮循环过程中许多氮的化合物都与一系列重大环境问题有关，地表氮循环的建立与氮循环的平衡中微生物起了主导作用。在地球生物圈的氮循环中，任何化合态的氮素的积累都会给整个循环带来严重的威胁。硝化作用在氮素循环中扮演着重要角色。生物圈中各个生态系统的氮素循环一般通过生物固氮，以氨的形式输入氮素；经过同化、氨化、硝化、异化性硝酸盐还原等生物转化作用及其相伴的迁移运动；最终借助反硝化作用，以氮气的形式输出氮素。因此，硝化细菌在促进水域生态系统的氮循环、进而缓解环境压力、保持健康水产养殖环境中发挥着巨大作用。此外，硝化细菌作为单细胞微生物，还是环境变化的敏感指标，比大型动、植物更宜于指示环境状况的变化。硝化细菌生态学也成为了国际上研究热点。
氮素是作物的主要营养元素，它对于作物的产量和品质关系极大。由于绝大部分红壤中都缺氮，因此，各地施用氮肥都有明显的增产效果，氮肥已经成为世界上生产和施用量最大的化肥。1992年我国氮肥施用量达到19×106t（养分量），占化肥总量的80%，迄今为止，我国化肥施用量已居世界首位，是美国的6.9倍[1]。大量氮肥投加到土壤中，已引起很多的环境问题[2]。如硝酸盐的淋失对地下水的污染，大量不合理施肥对土壤及作物的污染，反硝化作用损失的氮对大气臭氧层的破坏及所流失的氮素等汇集于河流、湖泊而造成水体的富营养化等问题。在好气条件下，硝化细菌通过硝化作用在氮素的转移过程中也起到了重要的作用，但是对于硝化细菌群落发生变化的研究相对较少，传统的硝化细菌生态学研究主要是通过富集纯化培养，借助显微镜观察，根据细胞的形态构造和生理生化特点来进行，使得对硝化细菌生态学的研究基本停留在总体计数水平，很难为其可靠的种群结构研究和系统发育分析提供证据；另一方面，由于硝化细菌的生长非常缓慢(氨氧化菌生长周期为(8~24 h)，许多种难以培养或至今尚未分离得到纯菌株，从而影响了对这类微生物的深入研究。此外，分离培养的菌种并不能代表环境样品中的细菌多样性[3]，因此，用分离培养方法来研究硝化细菌往往不能正确反映自然环境样品的真实情况，所以我们采用未培养的方法从分子水平来认识硝化细菌的群落组成信息与土壤成分变化之间的关系。
1 材料与方法
1．1 实验试剂
大肠杆菌DH10B由本实验室保存；
尿素、丙三醇、去离子甲酰胺购自上海生工生物公司，TA克隆载体pMD18T Vector购自Takara公司；
dNTP、Taq DNA聚合酶、IPTG、Xgal购自上海Genbase公司；
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溶菌酶、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）、SDS（十二烷基磺酸钠），DEPC (已二酸二已酯)，Trisbase（三羟甲基氨基甲烷）、酸性酚(pH5.2)、EDTA二钠盐等购自南京赛吉公司；
蛋白酶K为德国Merk公司产品；
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DS1高速组织捣碎机购自上海标本模型厂。
1．2 样品采集、保存及理化性质
实验采样的地点在湖南衡阳的中国农业科学院衡阳红壤实验站内。自行设计的养分淋溶试验小区，该小区位于湖南省衡阳中国农业科学院衡阳红壤实验站（东经116°55′30″，北纬28°15′20″），属于中亚热带湿润季风气候。试验用的大型排水采集器(lysimeter)为长2m×宽2 m的水泥池，为降低土壤原有机质的影响，选择荒地土壤作为供试土壤。
每年4月初至7月中旬在小区内种植玉米（山东登海一号），玉米收获后至次年4月休闲。试验使用养殖厂猪粪作为有机肥，设置四个处理，每个处理3个重复：1.CK，不施肥；2.LM，低量有机肥，150 kg N/hm2/a；3.HM，高量有机肥，600 kg N/hm2/a；4.ML，高量有机肥+石灰，600 kg N/hm2/a +石灰3000 kg/hm2/a。
采样时间在2014年7月下旬收获庄稼一周后，土壤样品均为五点混合样品，采样深度0 ~ 15 cm，在表层取样，每种土壤样品重约1kg。土壤采集后，用布袋封装，以增加样品的通气性。样品带回室内，除去根系、石块等杂物，过4 mm筛，保存在4℃冰箱中。取100 g土样，风干后用于理化性质测定；土壤含水量测定、微生物计数、土壤微生物活性测定等在1 ~ 2周内完成；另取一部分保存于70℃冰箱中用于土壤微生物总DNA提取。
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