表达TGEV S蛋白重组枯草芽孢杆菌的构建及其蛋白表达的验证
表达TGEV S蛋白重组枯草芽孢杆菌的构建及其蛋白表达的验证[20200614170210]
摘要：猪传染性胃肠炎（TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的高度接触性传染病。其中，TGEV S蛋白是TGEV主要诱导机体产生保护性中和抗体的结构蛋白。枯草芽孢杆菌因具有安全性高、易培养和运输、能激活机体免疫反应等特点，被认为是一种有潜力的黏膜疫苗递送载体。本实验通过构建枯草芽孢杆菌整合表达载体，将外源基因TGEV S蛋白通过AmyE整合位点定点整合到枯草芽孢杆菌基因组上，获得两株胞内表达和表面展示表达TGEV S蛋白的阳性重组枯草芽孢杆菌，用western-blot的方法和共聚焦显微镜的方法成功验证和观察其蛋白表达，为口服TGEV疫苗的发展奠定一定理论基础。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
关键字:TGEVS蛋白；枯草芽孢杆菌；载体构建；蛋白表达验证
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key Words 3
1.材料，试剂和仪器 4
2.实验方法 6
2.1载体构建 6
2.1.1引物设计 6
2.1.2质粒的提取 6
2.1.3枯草芽孢杆菌基因组的提取 6
2.1.4 PCR 反应体系 7
2.1.5基本质粒的构建 7
2.1.6 核酸电泳鉴定 PCR 产物 8
2.1.7 目的片段的回收 8
2.1.8 infusion连接 8
2.1.9 大肠杆菌XL10感受态细胞的制备 9
2.1.10 化学转化法转入大肠杆菌XL10感受态细胞 10
2.2重组枯草芽孢杆菌的制备 10
2.3蛋白表达的验证 10
3试验结果 11
3.1目的片段的扩增 11
3.2整合载体骨架构建 12
3.2.1载体构建 12
3.2.2 整合载体骨架构建验证 12
3.3整合载体的构建 13
3.3.1.胞内整合载体的构建 13
3.3.2胞内整合载体的验证 14
3.4.表面表示表达载体的构建 14
3.4.1表面表示载体的构建 15
3.4.2表面表示载体的验证 16
3.5蛋白表达验证 16
3.6共聚焦显微镜观察表面展示表达的枯草芽孢杆菌 16
4.讨论 17
4.1枯草芽孢杆菌WB800胞内表达载体的构建 17
4.2枯草芽孢杆菌W *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
B800表面表达载体的构建 17
4.3本研究的意义与目的 17
5.致谢 17
6.参考文献 18
表达TGEV S蛋白重组枯草芽孢杆菌的构建及其蛋白表达的验证
引言
引言
猪传染性胃肠炎（TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的高度接触性传染病[1]。TGE首次由Doyle和Hutchings[2]1946年在美国报道，日本[3]（1956年）和英国[4]（1957年）先后报道该病,这之后欧洲、北美、亚洲等多个国家相继报道发生了TGE，现已成为一种世界性猪的疾病[5]。我国从60年代起就有TGE的报道[6]，近些年来有进一步流行的趋势，尤其是冬季和早春寒冷季节常呈地方性暴发流行，是现今引起仔猪发病和死亡的主要原因之一，给养猪业造成极大危害。TGEV 的主要结构蛋白有纤突蛋白(S)、核蛋白(N)、膜结合蛋白(M) 和小膜蛋白(sM)[7-9]。其中, 由约4135 kb的S基因编码的S蛋白是唯一能够诱导机体产生保护性中和抗体的结构蛋白, 其在致病性、血凝性、决定宿主细胞亲嗜性及毒力等方面都起着关键作用[10]。S蛋白又可包括A、B、C、D 4 个主要抗原位点[11]。研究表明, A、D位点是主要诱导中和抗体产生的抗原位点[12]。近年来, S蛋白被分别在大肠杆菌[13]、鼠伤寒沙门氏菌[14]、痘病毒[15]、杆状病毒[16]、腺病毒以及植物细胞中得到表达。
枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌,非致病菌,其芽孢是其一种休眠体,能抵御外界恶劣的环境条件。该菌细胞壁不含内毒素,具有单层细胞外膜,动物肠道中枯草芽孢能直接分泌蛋白质到胞外。近年来发现芽孢杆菌对动物的一些病原菌具有颉颃作用。是一种理想的颉颃病原微生物的益生菌，对枯草芽孢杆菌的研究表明其可以通过发挥生物颉颃作用及分泌脂肽类细菌素等抗菌物质来抑制其他菌的生长。另外枯草芽孢杆菌还能刺激动物免疫器官的生长发育刺激Ｔ，Ｂ淋巴细胞提高免疫球蛋白和抗体水平增强细胞免疫和体液免疫力，小肠黏膜的天然免疫是防止病原微生物进入机体的第一道屏障，诱导和加强小肠黏膜的免疫反应将有利于抑制病原微生物的繁殖枯草芽孢杆菌是一种存在于动物的肠道中的有益菌,参与维持肠道内环境的平衡与稳定,且可刺激机体释放分泌型免疫球蛋白,有利于肠道黏膜的局部免疫,进而增强机体免疫力。因其对体液免疫和细胞免疫的特性,其菌体成为当今制备黏膜免疫疫苗的一种理想的疫苗载体。枯草芽孢杆菌具有独特的优势,使其能作为便于推广的疫苗载体进行研究。还能激活机体的免疫反应。具有外源蛋白表达系统，并且具有耐热、抗干燥、便于运输和使用等优点，是递送疫苗抗原和药物的理想载体。
1.材料，试剂和仪器
1.1菌种
枯草芽孢杆菌WB800：大学动物医学院杨倩教授实验室保存菌种
大肠杆菌XL10：大学动物医学院杨倩教授实验室保存菌种
1.2培养基及溶液配制
含有50μg/ml 卡那霉素(erythromyein)的LB液体培养基：氯化钠10g、蛋白胨10g、酵母粉5g,1000ml三蒸水充分溶解，118℃高压灭菌20min，待温度降到45℃以下时加入50mg红霉素。
含有50μg/ml 卡那霉素的LB固体培养基 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
：氯化钠10g、蛋白胨10g、酵母粉5g, 15g的琼脂,1000ml三蒸水充分溶解，118℃高压灭菌20min，待温度降至45—50℃以下[14]时加入50mg卡那霉素,震荡使充分溶解 。
PBS缓冲液（0.01 M）：氯化钠8.0 g、氯化钾0.2 g、十二水和磷酸氢二钠 3.5 g、磷酸二氢钾 0.2 g，三蒸水溶解，调节pH至7.2，定容至1 000 mL，磁力搅拌助溶，高压蒸气灭菌。
无菌生理盐水：氯化钠9.0g，三蒸水定容至1 000 mL，磁力搅拌助溶，高压蒸气灭菌。
1%凝胶电泳液：50×TAE 储液:三羟甲基氨基甲烷 242g、冰醋酸 57.1mL、0.5M 乙二胺四乙酸二钠(EDTA)100mL、ddH2O 补足 1000mL。使用时用蒸馏水稀释至 1×TAE。
Weste-blot试剂配制：?电泳缓冲液：Tris（MW121.14） 3.03g
甘氨酸（MW75.05） 18.77g
SDS 1g
蒸馏水至 1000mL
转移缓冲液：Tris（MW121.14） 5.8g
甘氨酸（MW75.05） 2.9g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
蒸馏水至 1000mL
摘要：猪传染性胃肠炎（TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的高度接触性传染病。其中，TGEV S蛋白是TGEV主要诱导机体产生保护性中和抗体的结构蛋白。枯草芽孢杆菌因具有安全性高、易培养和运输、能激活机体免疫反应等特点，被认为是一种有潜力的黏膜疫苗递送载体。本实验通过构建枯草芽孢杆菌整合表达载体，将外源基因TGEV S蛋白通过AmyE整合位点定点整合到枯草芽孢杆菌基因组上，获得两株胞内表达和表面展示表达TGEV S蛋白的阳性重组枯草芽孢杆菌，用western-blot的方法和共聚焦显微镜的方法成功验证和观察其蛋白表达，为口服TGEV疫苗的发展奠定一定理论基础。
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关键字:TGEVS蛋白；枯草芽孢杆菌；载体构建；蛋白表达验证
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key Words 3
1.材料，试剂和仪器 4
2.实验方法 6
2.1载体构建 6
2.1.1引物设计 6
2.1.2质粒的提取 6
2.1.3枯草芽孢杆菌基因组的提取 6
2.1.4 PCR 反应体系 7
2.1.5基本质粒的构建 7
2.1.6 核酸电泳鉴定 PCR 产物 8
2.1.7 目的片段的回收 8
2.1.8 infusion连接 8
2.1.9 大肠杆菌XL10感受态细胞的制备 9
2.1.10 化学转化法转入大肠杆菌XL10感受态细胞 10
2.2重组枯草芽孢杆菌的制备 10
2.3蛋白表达的验证 10
3试验结果 11
3.1目的片段的扩增 11
3.2整合载体骨架构建 12
3.2.1载体构建 12
3.2.2 整合载体骨架构建验证 12
3.3整合载体的构建 13
3.3.1.胞内整合载体的构建 13
3.3.2胞内整合载体的验证 14
3.4.表面表示表达载体的构建 14
3.4.1表面表示载体的构建 15
3.4.2表面表示载体的验证 16
3.5蛋白表达验证 16
3.6共聚焦显微镜观察表面展示表达的枯草芽孢杆菌 16
4.讨论 17
4.1枯草芽孢杆菌WB800胞内表达载体的构建 17
4.2枯草芽孢杆菌W *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
B800表面表达载体的构建 17
4.3本研究的意义与目的 17
5.致谢 17
6.参考文献 18
表达TGEV S蛋白重组枯草芽孢杆菌的构建及其蛋白表达的验证
引言
引言
猪传染性胃肠炎（TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的高度接触性传染病[1]。TGE首次由Doyle和Hutchings[2]1946年在美国报道，日本[3]（1956年）和英国[4]（1957年）先后报道该病,这之后欧洲、北美、亚洲等多个国家相继报道发生了TGE，现已成为一种世界性猪的疾病[5]。我国从60年代起就有TGE的报道[6]，近些年来有进一步流行的趋势，尤其是冬季和早春寒冷季节常呈地方性暴发流行，是现今引起仔猪发病和死亡的主要原因之一，给养猪业造成极大危害。TGEV 的主要结构蛋白有纤突蛋白(S)、核蛋白(N)、膜结合蛋白(M) 和小膜蛋白(sM)[7-9]。其中, 由约4135 kb的S基因编码的S蛋白是唯一能够诱导机体产生保护性中和抗体的结构蛋白, 其在致病性、血凝性、决定宿主细胞亲嗜性及毒力等方面都起着关键作用[10]。S蛋白又可包括A、B、C、D 4 个主要抗原位点[11]。研究表明, A、D位点是主要诱导中和抗体产生的抗原位点[12]。近年来, S蛋白被分别在大肠杆菌[13]、鼠伤寒沙门氏菌[14]、痘病毒[15]、杆状病毒[16]、腺病毒以及植物细胞中得到表达。
枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌,非致病菌,其芽孢是其一种休眠体,能抵御外界恶劣的环境条件。该菌细胞壁不含内毒素,具有单层细胞外膜,动物肠道中枯草芽孢能直接分泌蛋白质到胞外。近年来发现芽孢杆菌对动物的一些病原菌具有颉颃作用。是一种理想的颉颃病原微生物的益生菌，对枯草芽孢杆菌的研究表明其可以通过发挥生物颉颃作用及分泌脂肽类细菌素等抗菌物质来抑制其他菌的生长。另外枯草芽孢杆菌还能刺激动物免疫器官的生长发育刺激Ｔ，Ｂ淋巴细胞提高免疫球蛋白和抗体水平增强细胞免疫和体液免疫力，小肠黏膜的天然免疫是防止病原微生物进入机体的第一道屏障，诱导和加强小肠黏膜的免疫反应将有利于抑制病原微生物的繁殖枯草芽孢杆菌是一种存在于动物的肠道中的有益菌,参与维持肠道内环境的平衡与稳定,且可刺激机体释放分泌型免疫球蛋白,有利于肠道黏膜的局部免疫,进而增强机体免疫力。因其对体液免疫和细胞免疫的特性,其菌体成为当今制备黏膜免疫疫苗的一种理想的疫苗载体。枯草芽孢杆菌具有独特的优势,使其能作为便于推广的疫苗载体进行研究。还能激活机体的免疫反应。具有外源蛋白表达系统，并且具有耐热、抗干燥、便于运输和使用等优点，是递送疫苗抗原和药物的理想载体。
1.材料，试剂和仪器
1.1菌种
枯草芽孢杆菌WB800：大学动物医学院杨倩教授实验室保存菌种
大肠杆菌XL10：大学动物医学院杨倩教授实验室保存菌种
1.2培养基及溶液配制
含有50μg/ml 卡那霉素(erythromyein)的LB液体培养基：氯化钠10g、蛋白胨10g、酵母粉5g,1000ml三蒸水充分溶解，118℃高压灭菌20min，待温度降到45℃以下时加入50mg红霉素。
含有50μg/ml 卡那霉素的LB固体培养基 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
：氯化钠10g、蛋白胨10g、酵母粉5g, 15g的琼脂,1000ml三蒸水充分溶解，118℃高压灭菌20min，待温度降至45—50℃以下[14]时加入50mg卡那霉素,震荡使充分溶解 。
PBS缓冲液（0.01 M）：氯化钠8.0 g、氯化钾0.2 g、十二水和磷酸氢二钠 3.5 g、磷酸二氢钾 0.2 g，三蒸水溶解，调节pH至7.2，定容至1 000 mL，磁力搅拌助溶，高压蒸气灭菌。
无菌生理盐水：氯化钠9.0g，三蒸水定容至1 000 mL，磁力搅拌助溶，高压蒸气灭菌。
1%凝胶电泳液：50×TAE 储液:三羟甲基氨基甲烷 242g、冰醋酸 57.1mL、0.5M 乙二胺四乙酸二钠(EDTA)100mL、ddH2O 补足 1000mL。使用时用蒸馏水稀释至 1×TAE。
Weste-blot试剂配制：?电泳缓冲液：Tris（MW121.14） 3.03g
甘氨酸（MW75.05） 18.77g
SDS 1g
蒸馏水至 1000mL
转移缓冲液：Tris（MW121.14） 5.8g
甘氨酸（MW75.05） 2.9g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
蒸馏水至 1000mL
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