高温胁迫下血红素单加氧酶调控灵芝三萜合成的机制
：本实验确定了对灵芝菌丝合成三萜及生长造成显著影响的胁迫温度。在此实验基础上，在灵芝液体培养条件下分别检测了野生型和HO沉默转化子的生物量和三萜含量，通过回补HO催化产物CO确定了高温胁迫能够提高灵芝三萜的含量，并且HO响应高温胁迫抑制灵芝三萜合成，为进一步研究高温胁迫对灵芝次生代谢的影响奠定了基础。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1 材料与方法3
1.1 材料 3
1.1.1 供试菌株3
1.1.2 CYM培养基3
1.2.3 主要试剂与溶液3
1.2.4 主要仪器设备3
1.2 方法 3
1.2.1 菌种培养3
1.2.2 灵芝菌丝生物量测定3
1.2.3 灵芝三萜含量的测定4
1.2.4 CO制备4
2 结果与分析4
2.1 高温胁迫对灵芝菌丝生物量的影响4
2.2 高温胁迫对灵芝菌丝三萜含量的影响4
2.3 高温胁迫下不同浓度CO对灵芝三萜合成的影响5
2.4 高温胁迫下CO对野生型中灵芝三萜合成的影响5
2.5 高温胁迫下CO对HO沉默转化子中灵芝三萜合成的影响6
3 讨论 6
3.1 HO沉默转化子中高温胁迫处理对于菌丝生长和次生代谢的影响6
3.2 高温胁迫下HO作用机理的探讨7
致谢7
参考文献7
高温胁迫下血红素单加氧酶调控灵芝三萜合成的机制
生物科学 李宪刚
引言
引言
灵芝(G. lucidum）隶属非褶菌目(Aphyllophorales)灵芝科(Ganodermataceae)灵芝属真菌，在我国有悠久的药用历史。灵芝中的生物碱、多肽、多糖、三萜、微量元素等成分是其有效的药用成分，而三萜则是主要活性成分之一，目前已发现大约有二百种。药理学研究表明三萜类灵芝酸在保护肝功能、抗肿瘤、抗氧化
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、抗HIV蛋白酶活性方面有重要作用。如何提高灵芝三萜的含量特别是通过环境因子诱导是目前研究的重点。
高温胁迫作为一种环境因子，能够普遍地影响有机物的合成。在大豆中高温胁迫处理可以提高大豆萜类合酶GmTPS的表达，从而降低高温胁迫对植物细胞膜造成的过氧化伤害。Zhang等（1999）的研究证实了萜类化合物的释放量与温度呈正相关，这与其抗热性假说有关，如异戊二烯在高温时具有稳定类囊体膜的作用，以及降低活性氧成分例如臭氧分子对细胞膜的破坏。而灵芝作为一种耐高温真菌，高温胁迫处理并不常见。
血红素加氧酶（heme oxygenase, HO）是催化血红素（heme）降解的起始酶和限速酶，广泛存在于动植物以及真菌、细菌中，其代谢产物为一氧化碳（carbon monoxide, CO）、胆绿素（biliberdin BV）和Fe2+。目前发现有三种不同类型的HO，其中HO1属于诱导型血红素加氧酶，是一种响应非生物胁迫的基因，能被较多的氧化应激源激活。
现有医学及动物学研究表明，冠心病患者的血浆脂联素与HO1密切相关，可能存在相互调节的作用。HO1表达量的增加可降低高糖与高脂对动物内皮细胞的损伤。HO1在ApoE缺陷小鼠中表达，发挥抗炎、抗凋亡作用，同时HO1也诱导CO的释放，具有拮抗动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）炎症反应，防治AS的作用。在植物中，血红素加氧酶/一氧化碳信号系统在黄瓜不定根发生过程中可起到一定的诱导调控作用，同时，该系统也参与调控渗透胁迫下小麦种子的萌发以及幼苗的脱黄化。在紫花苜蓿中HO还可以响应氧化胁迫对Hg2+诱导根部细胞的氧化损伤起到保护作用。在菌类研究中，尚无有关HO基因介导非生物胁迫耐性的功能的研究。
因此，本课题通过研究高温胁迫对HO沉默转化子生物量和三萜合成的影响，并通过回补HO催化产物CO，探讨HO与灵芝三萜合成的关系，为阐明通过高温胁迫影响次生代谢产物灵芝三萜生物合成的分子机制奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 供试菌株 灵芝HO沉默突变菌株。
1．1．2 CYM培养基 液体发酵培养基：麦芽糖10g，葡萄糖20 g，酵母提取物2g，蛋白胨2g，七水硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾4.6g，定容至1000 mL，在115 ℃下灭菌30 min后使用。
固体培养基：将1%琼脂粉加入液体培养基中，115 ℃下灭菌30 min后使用。
1．1．3 主要试剂与溶液
1．1．3．1 主要试剂 甲酸、浓硫酸、NaOH、乙酸、盐酸、高氯酸、95%乙醇、无水乙醇、香兰素、醋酸钠、齐墩果酸、荧光增白剂。
1．1．3．2 主要溶液 香草醛：将5 g香兰素加入100 mL冰醋酸溶解即可制备香草醛。
1．1．4 主要仪器设备 28 ℃恒温培养箱、42℃恒温培养箱、烘箱、分析天平、天平、小型种子打碎机、摇床、超声波清洗仪、无菌超净台、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅、722可见分光光度计、荧光显微镜．
1．2 方法
1．2．1 菌种培养
1．2．1．1 菌种平板活化 将斜面培养基保存的母种接种至平板培养基上，置于28 ℃恒温培养至菌丝长满平板。
1．2．1．2 液体种子摇瓶培养 将400 mL CYM培养基装入1000 mL三角瓶，选取长势较好的平板，用Ф=6 mm的无菌打孔器在其上打孔，将12块平板母种接种于三角瓶中，放入150 r/min，28 ℃摇床培养7天。
1．2．1．3 二次摇瓶发酵培养 小型种子打碎机将摇瓶培养的液体种子匀浆打碎，将100 mL液体培养基装入250 mL摇瓶，接种量10 %。放入150 r/min, 28 ℃摇床培养7天。
1．2．2 灵芝菌丝生物量测定 发酵结束后，将菌丝球用20目筛网收集起来，将培养基完全洗干净。将烘干至恒重的培养皿放入干燥器中冷却后称重，将洗净后的灵芝菌丝收集到编号培养皿中，放入60 ℃烘箱中烘干至恒重，称重，计算菌丝生物量。
1．2．3 灵芝三萜含量的测定
1．2．3．1 齐墩果酸标准曲线制备 分别将齐墩果酸标准液0、100、200、400、600、800、1000 μL加入各试管，放入60 ℃烘箱中挥干乙醇。每管依次加入0.10mL 95%乙醇，0.20 mL香草醛，0.50 mL高氯酸，摇匀，60℃水浴20 min，取出后立即冰浴10 min，加5 mL冰醋酸，混匀后于550 nm处测定吸光值（以0号管为空白对照）。以OD550为纵坐标，齐墩果酸含量为横坐标（六个点为10、20、40、60、80、100 ug），在坐标轴上绘制标准曲线，利用标准曲线查出回归方程[10]。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1 材料与方法3
1.1 材料 3
1.1.1 供试菌株3
1.1.2 CYM培养基3
1.2.3 主要试剂与溶液3
1.2.4 主要仪器设备3
1.2 方法 3
1.2.1 菌种培养3
1.2.2 灵芝菌丝生物量测定3
1.2.3 灵芝三萜含量的测定4
1.2.4 CO制备4
2 结果与分析4
2.1 高温胁迫对灵芝菌丝生物量的影响4
2.2 高温胁迫对灵芝菌丝三萜含量的影响4
2.3 高温胁迫下不同浓度CO对灵芝三萜合成的影响5
2.4 高温胁迫下CO对野生型中灵芝三萜合成的影响5
2.5 高温胁迫下CO对HO沉默转化子中灵芝三萜合成的影响6
3 讨论 6
3.1 HO沉默转化子中高温胁迫处理对于菌丝生长和次生代谢的影响6
3.2 高温胁迫下HO作用机理的探讨7
致谢7
参考文献7
高温胁迫下血红素单加氧酶调控灵芝三萜合成的机制
生物科学 李宪刚
引言
引言
灵芝(G. lucidum）隶属非褶菌目(Aphyllophorales)灵芝科(Ganodermataceae)灵芝属真菌，在我国有悠久的药用历史。灵芝中的生物碱、多肽、多糖、三萜、微量元素等成分是其有效的药用成分，而三萜则是主要活性成分之一，目前已发现大约有二百种。药理学研究表明三萜类灵芝酸在保护肝功能、抗肿瘤、抗氧化
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、抗HIV蛋白酶活性方面有重要作用。如何提高灵芝三萜的含量特别是通过环境因子诱导是目前研究的重点。
高温胁迫作为一种环境因子，能够普遍地影响有机物的合成。在大豆中高温胁迫处理可以提高大豆萜类合酶GmTPS的表达，从而降低高温胁迫对植物细胞膜造成的过氧化伤害。Zhang等（1999）的研究证实了萜类化合物的释放量与温度呈正相关，这与其抗热性假说有关，如异戊二烯在高温时具有稳定类囊体膜的作用，以及降低活性氧成分例如臭氧分子对细胞膜的破坏。而灵芝作为一种耐高温真菌，高温胁迫处理并不常见。
血红素加氧酶（heme oxygenase, HO）是催化血红素（heme）降解的起始酶和限速酶，广泛存在于动植物以及真菌、细菌中，其代谢产物为一氧化碳（carbon monoxide, CO）、胆绿素（biliberdin BV）和Fe2+。目前发现有三种不同类型的HO，其中HO1属于诱导型血红素加氧酶，是一种响应非生物胁迫的基因，能被较多的氧化应激源激活。
现有医学及动物学研究表明，冠心病患者的血浆脂联素与HO1密切相关，可能存在相互调节的作用。HO1表达量的增加可降低高糖与高脂对动物内皮细胞的损伤。HO1在ApoE缺陷小鼠中表达，发挥抗炎、抗凋亡作用，同时HO1也诱导CO的释放，具有拮抗动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）炎症反应，防治AS的作用。在植物中，血红素加氧酶/一氧化碳信号系统在黄瓜不定根发生过程中可起到一定的诱导调控作用，同时，该系统也参与调控渗透胁迫下小麦种子的萌发以及幼苗的脱黄化。在紫花苜蓿中HO还可以响应氧化胁迫对Hg2+诱导根部细胞的氧化损伤起到保护作用。在菌类研究中，尚无有关HO基因介导非生物胁迫耐性的功能的研究。
因此，本课题通过研究高温胁迫对HO沉默转化子生物量和三萜合成的影响，并通过回补HO催化产物CO，探讨HO与灵芝三萜合成的关系，为阐明通过高温胁迫影响次生代谢产物灵芝三萜生物合成的分子机制奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 供试菌株 灵芝HO沉默突变菌株。
1．1．2 CYM培养基 液体发酵培养基：麦芽糖10g，葡萄糖20 g，酵母提取物2g，蛋白胨2g，七水硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾4.6g，定容至1000 mL，在115 ℃下灭菌30 min后使用。
固体培养基：将1%琼脂粉加入液体培养基中，115 ℃下灭菌30 min后使用。
1．1．3 主要试剂与溶液
1．1．3．1 主要试剂 甲酸、浓硫酸、NaOH、乙酸、盐酸、高氯酸、95%乙醇、无水乙醇、香兰素、醋酸钠、齐墩果酸、荧光增白剂。
1．1．3．2 主要溶液 香草醛：将5 g香兰素加入100 mL冰醋酸溶解即可制备香草醛。
1．1．4 主要仪器设备 28 ℃恒温培养箱、42℃恒温培养箱、烘箱、分析天平、天平、小型种子打碎机、摇床、超声波清洗仪、无菌超净台、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅、722可见分光光度计、荧光显微镜．
1．2 方法
1．2．1 菌种培养
1．2．1．1 菌种平板活化 将斜面培养基保存的母种接种至平板培养基上，置于28 ℃恒温培养至菌丝长满平板。
1．2．1．2 液体种子摇瓶培养 将400 mL CYM培养基装入1000 mL三角瓶，选取长势较好的平板，用Ф=6 mm的无菌打孔器在其上打孔，将12块平板母种接种于三角瓶中，放入150 r/min，28 ℃摇床培养7天。
1．2．1．3 二次摇瓶发酵培养 小型种子打碎机将摇瓶培养的液体种子匀浆打碎，将100 mL液体培养基装入250 mL摇瓶，接种量10 %。放入150 r/min, 28 ℃摇床培养7天。
1．2．2 灵芝菌丝生物量测定 发酵结束后，将菌丝球用20目筛网收集起来，将培养基完全洗干净。将烘干至恒重的培养皿放入干燥器中冷却后称重，将洗净后的灵芝菌丝收集到编号培养皿中，放入60 ℃烘箱中烘干至恒重，称重，计算菌丝生物量。
1．2．3 灵芝三萜含量的测定
1．2．3．1 齐墩果酸标准曲线制备 分别将齐墩果酸标准液0、100、200、400、600、800、1000 μL加入各试管，放入60 ℃烘箱中挥干乙醇。每管依次加入0.10mL 95%乙醇，0.20 mL香草醛，0.50 mL高氯酸，摇匀，60℃水浴20 min，取出后立即冰浴10 min，加5 mL冰醋酸，混匀后于550 nm处测定吸光值（以0号管为空白对照）。以OD550为纵坐标，齐墩果酸含量为横坐标（六个点为10、20、40、60、80、100 ug），在坐标轴上绘制标准曲线，利用标准曲线查出回归方程[10]。
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