麦草畏脱甲基酶基因的表达载体构建
：麦草畏是一种苯甲酸类除草剂，因广谱高效、杂草抗性产生慢等优点而广泛使用。本实验室分离筛选到一株能够高效降解麦草畏的降解菌株Sphingomonas sp. Ndbn-20。经比对分析发现其基因组中存在能够降解麦草畏的脱甲基酶基因簇DMT66。通过将该基因簇上的各基因序列用高保真DNA聚合酶扩增并连接到pET29a(+)表达载体，并转化到E. coli BL21(DE3)中进行表达，测定粗酶对麦草畏的转化情况，通过紫外扫描仪和高效液相色谱仪检测和鉴定转化产物，并已经初步确定DMT66-4基因无降解效应。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言4
1材料与方法4
1.1 试剂与培养基4
1.2供试菌株与质粒4
1.3 Ndbn20菌株降解麦草畏能力确认5
1.4 Ndbn20菌体细胞获取5
1.5菌株基因组DNA提取5
1.6麦草畏脱甲基酶基因片段克隆载体构建5
1.6.1PCR扩增5
1.6.2 PCR产物TA克隆6
1.6.3酶连产物转化6
1.6.4 质粒DNA的小量提取6
1.6.5测序比对6
1.7 麦草畏脱甲基酶基因片段表达载体构建6
1.7.1脱甲基酶基因片段与pET29a质粒的双酶切回收6
1.7.2 酶切产物的酶连、转化与筛选7
1.8 重组表达菌株对麦草畏的降解7
1.8.1重组表达菌株降解麦草畏7
1.8.2 重组表达菌株粗酶提取液降解麦草畏7
2结果与分析7
2.1Ndbn20菌株降解麦草畏能力确认 7
2.2基因组DNA提取琼脂糖凝胶电泳结果8
2.3 麦草畏脱甲基酶基因表达载体构建结果9
2.4麦草畏脱甲基酶基因重组表达菌株降解能力探究10
3讨论11
致谢11
参考文献12
麦草畏脱甲基酶基因的表达载体构建
引言
1麦草畏简介
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
1.1麦草畏理化性质
麦草畏又称百草敌、麦草威，是一种苯甲酸类除草剂，化学名为3，6二氯2甲氧基苯甲酸，分子式为C8H6Cl2O3（如图1），相对分子量为221，属安息香酸系除草剂[1]，具有内吸传导作用及广谱高效低毒的特点。
图1 麦草畏结构式
1.2麦草畏的用途
麦草畏用于苗后喷雾，药剂能很快被杂草的叶、茎、根吸收，通过韧皮部向上、下传导，多集中在分生组织及代谢活动旺盛的部位，阻碍植物激素的正常活动，从而使杂草死亡。对一年生和多年生阔叶杂草有显著防除效果，而对禾本科作物则较安全[2]。
1.3麦草畏的危害
随着氯磺隆和甲磺隆等除草剂的禁用或限用, 麦草畏作为一种新兴、高效、广谱除草剂，现已在国外农业上获得广泛应用。麦草畏高效、低毒，使得其在农业生产上的使用量增加。对我国这样一个农药使用大国而言，具有更广阔的应用空间。然而，虽然麦草畏在土壤中的半衰期较短，为1425d,但是大量使用，长期富集残留在环境中的麦草畏数量还是惊人的。有研究表明，麦草畏会抑制人体神经系统乙酰胆碱酯酶，同时能增加非霍奇金淋巴癌的患病几率，能使试验动物体重、肝脏受损，易使雌性堕胎，严重时会致盲[3]，能导致人体血细胞、细菌和大麦的基因损坏。因此，麦草畏使用之后的环境效应及其修复技术越来越受到学者们的关注。
2 麦草畏降解研究现状
2.1麦草畏微生物降解菌株筛选和代谢途径方面的研究进展
麦草畏化学性质较稳定，施入灭菌土壤后麦草畏消失缓慢，但在不灭菌的自然土壤中很快消失，表明微生物代谢是土壤中麦草畏降解的主要因素[4],[5]。Krueger et al.（1989）从农药厂处理麦草畏废水的氧化塘污泥中分离到三株麦草畏降解菌株Stenotrophomonas(以前为Pseudomonas)maltophilia DI6、Moraxella. sp. DI7和Pseudomonas sp. DI8，这些菌株降解麦草畏的起始步骤都是脱甲基，生成无除草活性的3,6二氯水杨酸（图2）。另一个报道菌株是厌氧嗜热产乙酸细菌Moorella thermoacetica ATCC 39073，该菌能在厌氧条件下对麦草畏进行脱甲基，利用脱下的甲基作为一碳化合物生长，但不能降解余下的苯环[6]。
图2 微生物降解麦草畏的起始步骤
2.2麦草畏脱甲基酶和基因研究进展
在分子结构上，麦草畏是甲氧基取代芳烃类化合物。很多重要的天然产物（如咖啡因、丁香酸和香草酸等）和人工合成化合物（如绿麦隆、利谷隆和甲草胺等）都是甲氧基取代芳烃，该类化合物微生物降解起始步骤往往是脱甲基，催化这一反应的酶叫脱甲基酶（demethylase）。研究脱甲基酶的特性、结构和功能对阐明甲氧基取代芳烃微生物降解机制具有重要意义。目前已报道的与甲氧基取代芳烃降解有关的脱甲基酶主要有以下4种类型：Rieske非血红素铁氧化酶（Rieske nonheme iron oxygenase, RHO）、细胞色素P450、存在于好氧细菌中的四氢叶酸依赖型脱甲基酶和存在于厌氧细菌中的四氢叶酸依赖型脱甲基酶。
1）RHO类脱甲基酶
RHO是一类含有Rieske [FeS]中心的加氧酶系，一般由一个末端氧化酶，一个还原酶和一个铁氧还蛋白组成，依赖NAD(P)H提供还原力。很多催化O甲基和N甲基化合物的脱甲基酶都是RHO，如香草醛脱甲基酶VanA[7]，[8]、参与咖啡因N1, N3和N7连续脱甲基的脱甲基酶NdmA、NdmB和NdmC[9]、异丙隆N脱甲基酶PudmAB[10]和甲草胺脱甲基酶CndABC[11]等。
Wang et al.（1997）[12]和Herman et al.（2005）[13]通过蛋白纯化和末端测序技术从Stenotrophomonasmaltophilia DI6中获得一个RHO类的麦草畏脱甲基酶DMO（dicamba monooxygenase）及其编码基因。美国NebraskaLincoln大学研究人员对DMO的特性、晶体结构和催化机制进行了深入研究[12]。
在应用方面，Behrens et al.（2007）[14]将DMO基因导入烟草，并通过转运肽将DMO定位于烟草细胞叶绿体（叶绿体中NADH非常丰富，可为DMO提供还原力），获得的转基因烟草对麦草畏表现出极强的抗性，孟山都利用DMO基因研发了抗麦草畏转基因大豆和棉花。
2）好氧细菌的四氢叶酸依赖型脱甲基酶
该类脱甲基酶最早发现于木质素降解菌Sphingobium sp. SYK6[15]。Nishikawa et al.（1998）[16]通过Tn5插入突变获得一个不能催化香草酸和丁香酸脱甲基的Sphingobium sp. SYK6突变子，发现Tn5插入到一个与四氢叶酸代谢相关的基因ligH（甲酰四氢叶酸脱甲酰酶）中，从而将香草酸和丁香酸脱甲基与四氢叶酸代谢联系起来，随后Masai et al.（2004）[17]和Abe et al.（2005）[18]分别克隆到脱甲基酶基因desA和ligM。纯化的DesA和LigM在加入四氢叶酸的TrisHCl缓冲体系中能催化香草酸和丁香酸脱甲基的脱甲基。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言4
1材料与方法4
1.1 试剂与培养基4
1.2供试菌株与质粒4
1.3 Ndbn20菌株降解麦草畏能力确认5
1.4 Ndbn20菌体细胞获取5
1.5菌株基因组DNA提取5
1.6麦草畏脱甲基酶基因片段克隆载体构建5
1.6.1PCR扩增5
1.6.2 PCR产物TA克隆6
1.6.3酶连产物转化6
1.6.4 质粒DNA的小量提取6
1.6.5测序比对6
1.7 麦草畏脱甲基酶基因片段表达载体构建6
1.7.1脱甲基酶基因片段与pET29a质粒的双酶切回收6
1.7.2 酶切产物的酶连、转化与筛选7
1.8 重组表达菌株对麦草畏的降解7
1.8.1重组表达菌株降解麦草畏7
1.8.2 重组表达菌株粗酶提取液降解麦草畏7
2结果与分析7
2.1Ndbn20菌株降解麦草畏能力确认 7
2.2基因组DNA提取琼脂糖凝胶电泳结果8
2.3 麦草畏脱甲基酶基因表达载体构建结果9
2.4麦草畏脱甲基酶基因重组表达菌株降解能力探究10
3讨论11
致谢11
参考文献12
麦草畏脱甲基酶基因的表达载体构建
引言
1麦草畏简介
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
1.1麦草畏理化性质
麦草畏又称百草敌、麦草威，是一种苯甲酸类除草剂，化学名为3，6二氯2甲氧基苯甲酸，分子式为C8H6Cl2O3（如图1），相对分子量为221，属安息香酸系除草剂[1]，具有内吸传导作用及广谱高效低毒的特点。
图1 麦草畏结构式
1.2麦草畏的用途
麦草畏用于苗后喷雾，药剂能很快被杂草的叶、茎、根吸收，通过韧皮部向上、下传导，多集中在分生组织及代谢活动旺盛的部位，阻碍植物激素的正常活动，从而使杂草死亡。对一年生和多年生阔叶杂草有显著防除效果，而对禾本科作物则较安全[2]。
1.3麦草畏的危害
随着氯磺隆和甲磺隆等除草剂的禁用或限用, 麦草畏作为一种新兴、高效、广谱除草剂，现已在国外农业上获得广泛应用。麦草畏高效、低毒，使得其在农业生产上的使用量增加。对我国这样一个农药使用大国而言，具有更广阔的应用空间。然而，虽然麦草畏在土壤中的半衰期较短，为1425d,但是大量使用，长期富集残留在环境中的麦草畏数量还是惊人的。有研究表明，麦草畏会抑制人体神经系统乙酰胆碱酯酶，同时能增加非霍奇金淋巴癌的患病几率，能使试验动物体重、肝脏受损，易使雌性堕胎，严重时会致盲[3]，能导致人体血细胞、细菌和大麦的基因损坏。因此，麦草畏使用之后的环境效应及其修复技术越来越受到学者们的关注。
2 麦草畏降解研究现状
2.1麦草畏微生物降解菌株筛选和代谢途径方面的研究进展
麦草畏化学性质较稳定，施入灭菌土壤后麦草畏消失缓慢，但在不灭菌的自然土壤中很快消失，表明微生物代谢是土壤中麦草畏降解的主要因素[4],[5]。Krueger et al.（1989）从农药厂处理麦草畏废水的氧化塘污泥中分离到三株麦草畏降解菌株Stenotrophomonas(以前为Pseudomonas)maltophilia DI6、Moraxella. sp. DI7和Pseudomonas sp. DI8，这些菌株降解麦草畏的起始步骤都是脱甲基，生成无除草活性的3,6二氯水杨酸（图2）。另一个报道菌株是厌氧嗜热产乙酸细菌Moorella thermoacetica ATCC 39073，该菌能在厌氧条件下对麦草畏进行脱甲基，利用脱下的甲基作为一碳化合物生长，但不能降解余下的苯环[6]。
图2 微生物降解麦草畏的起始步骤
2.2麦草畏脱甲基酶和基因研究进展
在分子结构上，麦草畏是甲氧基取代芳烃类化合物。很多重要的天然产物（如咖啡因、丁香酸和香草酸等）和人工合成化合物（如绿麦隆、利谷隆和甲草胺等）都是甲氧基取代芳烃，该类化合物微生物降解起始步骤往往是脱甲基，催化这一反应的酶叫脱甲基酶（demethylase）。研究脱甲基酶的特性、结构和功能对阐明甲氧基取代芳烃微生物降解机制具有重要意义。目前已报道的与甲氧基取代芳烃降解有关的脱甲基酶主要有以下4种类型：Rieske非血红素铁氧化酶（Rieske nonheme iron oxygenase, RHO）、细胞色素P450、存在于好氧细菌中的四氢叶酸依赖型脱甲基酶和存在于厌氧细菌中的四氢叶酸依赖型脱甲基酶。
1）RHO类脱甲基酶
RHO是一类含有Rieske [FeS]中心的加氧酶系，一般由一个末端氧化酶，一个还原酶和一个铁氧还蛋白组成，依赖NAD(P)H提供还原力。很多催化O甲基和N甲基化合物的脱甲基酶都是RHO，如香草醛脱甲基酶VanA[7]，[8]、参与咖啡因N1, N3和N7连续脱甲基的脱甲基酶NdmA、NdmB和NdmC[9]、异丙隆N脱甲基酶PudmAB[10]和甲草胺脱甲基酶CndABC[11]等。
Wang et al.（1997）[12]和Herman et al.（2005）[13]通过蛋白纯化和末端测序技术从Stenotrophomonasmaltophilia DI6中获得一个RHO类的麦草畏脱甲基酶DMO（dicamba monooxygenase）及其编码基因。美国NebraskaLincoln大学研究人员对DMO的特性、晶体结构和催化机制进行了深入研究[12]。
在应用方面，Behrens et al.（2007）[14]将DMO基因导入烟草，并通过转运肽将DMO定位于烟草细胞叶绿体（叶绿体中NADH非常丰富，可为DMO提供还原力），获得的转基因烟草对麦草畏表现出极强的抗性，孟山都利用DMO基因研发了抗麦草畏转基因大豆和棉花。
2）好氧细菌的四氢叶酸依赖型脱甲基酶
该类脱甲基酶最早发现于木质素降解菌Sphingobium sp. SYK6[15]。Nishikawa et al.（1998）[16]通过Tn5插入突变获得一个不能催化香草酸和丁香酸脱甲基的Sphingobium sp. SYK6突变子，发现Tn5插入到一个与四氢叶酸代谢相关的基因ligH（甲酰四氢叶酸脱甲酰酶）中，从而将香草酸和丁香酸脱甲基与四氢叶酸代谢联系起来，随后Masai et al.（2004）[17]和Abe et al.（2005）[18]分别克隆到脱甲基酶基因desA和ligM。纯化的DesA和LigM在加入四氢叶酸的TrisHCl缓冲体系中能催化香草酸和丁香酸脱甲基的脱甲基。
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