拟南芥重金属转运蛋白的克隆
拟南芥重金属转运蛋白的克隆[20200614172515]
摘要：背景：土壤中的重金属不仅对植物有害，也可通过食物链危害人类和动物的健康。植物对土壤的吸收和解毒是一个精密的调控过程，具有非常复杂的分子生物学机制。重金属转运蛋白在整个调控过程中发挥关键作用，参与了吸收、螯合、区室化和代谢利用等关键步骤。 目的：克隆拟南芥重金属转运蛋白。 方法：本实验以拟南芥为实验材料，提取全长cDNA，并以该cDNA作为模板，采用RT-PCR技术等基因工程及分子生物学手段克隆基因。 结果：成功克隆拟南芥根瘤素MtN21/类EamA转运蛋白家族、类EamA转运蛋白家族、镁转运蛋白6、锌转运体4前体、ABC转运蛋白家族、金属蛋白酶M24家族蛋白、钙调神经磷酸酶类金属磷酸酯酶超家族蛋白等7个转运蛋白基因，这些基因均为重金属转运蛋白基因，为解决重金属污染研究奠定基础。
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关键字:拟南芥；重金属；转运蛋白；基因
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1植物材料及处理3
1.1.2菌株与材料3
1.2.3酶与试剂3
1.2方法 3
1.2.1拟南芥总RNA的提取3
1.2.2cDNA的合成3
1.2.3引物的设计及合成4
1.2.4引物最适退火温度的测定4
1.2.5在最适退火温度进行PCR扩增并回收PCR4
1.2.6构建T载体并转化4
1.2.7菌落PCR并测序4
1.2.8构建PFL61-基因质粒5
2结果与分析5
2.1拟南芥基因引物的设计及最适退火温度的测定5
2.1.1拟南芥基因引物的设计结果5
2.1.2最适退火温度的测定5
2.2测序结果6
2.3单酶切构建重组质粒基因结果7
3讨论 8
3.1转运蛋白与重金属污染治理 8
3.2结果展望 9
致谢10
参考文献10
拟南芥重金属转运蛋白的克隆
引言
引言 重金属指比重大于4或5的金属，如镉、铜、铅、铁、镁、锰等，重金属污染的特点有：①污染的范围广②污染的持续时间长③性质稳定[1] ，在环境中不易降解。痕量重金属如Pd、Cr、Cd等可通过“土壤—植物—人体”或“土壤—水—人体”食物链进入人体，破坏正常的生理代谢活动，危害人类健康[2]。土壤重金属污染是指由于人类的活动将重金属带入 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
土壤中，致使土壤重金属含量明显高于其自然背景值，并造成生态破坏和环境质量恶化的现象。随着人口数量的增加，工业规模不断扩大，在农业生产中大量使用化肥农药等，在这些生产活动中的重金属进入土壤系统，形成土壤重金属污染。目前，土壤重金属污染越来越严重，引起全世界范围的关注。土壤重金属污染会抑制微生物活动，无法分解土壤中有毒物质，最终危害人体健康[3-4]。进入20世纪，随着工农业的发展许多种金属污染物通过大气沉降、地矿渗漏及工业废水、生活污水等途径进入土壤，使土壤中富集过多的重金属[5]。有资料表明，我国因重金属污染而导致的经济损失至少200亿元，解决重金属污染问题迫在眉睫[6]。
目前采用的修复方法如物理化学常规方法，不仅昂贵，难以大规模应用，而且常导致土壤结构破坏、肥力下降，降低土地的使用功能和应用价值。以成本低，不破坏土壤和河流生态环境、不引起二次污染等未能特点的植物修复技术正受到学术界的日益密切的关注表现出了广阔的市场前景。目前美国已开始采用荠菜吸收Pb，利用杂交白杨和草类修复重金属污染的土壤。植物修复是利用绿色植物转移、容纳或转化污染使其对环境无害的技术。
其中各种转运蛋白在植物修复中起关键性作用。重金属转运蛋白分为吸收蛋白 ( metal uptake proteins)和排出蛋白(metal efflux proteins)两大类[7]。其中，吸收蛋白主要有：YSL蛋白家族、锌铁蛋白 ( ZIP)家族、天然抗性巨嗜细胞蛋白家族(NRAMP)等，主要位于细胞质膜上，其功能是将重金属转运至细胞质；排出蛋白包括P1B型ATPases、CDF蛋白家族等，其功能是将重金属排出细胞质，或运载至液泡，在植物耐受重金属胁迫中起到积极的防御作用。近年来随着分子生物学等现代技术手段的引入，人们对植物修复过程中金属离子如何进入细胞有了更新的认识。越来越多的修复性蛋白的基因正从植物、微生物和动物中陆续克隆得到。其中存在于生物膜上的各种阳离子转运蛋白在植物修复中起尤为关键的作用。在超富集植物中已经克隆出多个家族的金属运载蛋白基因，这些基因表达出的金属阳离子跨膜运载蛋白可能决定性地参与了重金属在根部的吸收、木质部的装载以及液泡的区室化[8]，在细胞中重金属运输、分布和富集及提高植物抗性方面发挥了极其重要作用。另一方面，一些重金属离子还原酶基因如Hg离子还原酶基因merA、有机汞裂解酶基因merB、Hg转运蛋白基因merT、金属S蛋白基因MTs、植物络合素合成酶基因PCs的发现和克隆为准确了解植物修复的生化及分子机制准备了最基本的条件[9]。
拟南芥（Arabidopsis thaliana）为十字花科（Crucifereae），拟南芥属一年生草本植物。选择它做材料的有点：①具有生长周期短②种子繁殖系数高③易于遗传转化④个体小⑤便于栽培管理等。拟南芥被当做模式植物，广泛应用到植物生物学的各个领域。拟南芥的基因组小，约125Mb，并且其基因组的全序列物理图谱已于2000年12月公布，是本实验的重要实验材料[10]。
载体使用的是PMD-19-T载体，是一种高效克隆PCR产物的专用载体，本载体由pUC19载体改建而成，在pUC19 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
earch?word=pUC19&fr=qb_search_exp&ie=utf8>载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点 之间插入了EcoR V识别位点 ，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3’端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶 进行PCR反应时都有在PCR 产物的3’末端添加一个“A”的特性，所以使用PMD-19-T载体可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。高效连接液Solution I可以在短时间内完成连接反应 ，其连接液可以直接用于细菌转化 ，大大方便了实验操作。
本次试验克隆的基因均有上游开放阅读框（upstream open reading frame，uORF），（表1）是一类短小的开放阅读框（ORF），位于成熟 mRNA 5端非编码区（5-UTR）。在细菌中，uORF 被称为前导肽，影响与氨基酸的合成和运输有关的基因表达。在真核生物中位于信使RNA 5非翻译区域 （5-UTR），调控下游主要开放阅读框ORF（mORF）的翻译。核糖体从mRNA的5端方向滑动扫描uORF起始密码子（uAUG），可能通过重新起始机制继续扫描，识别mORF的起始密码子（mAUG），直到mAUG启动翻译下游mORF，但是，当不能重新起始翻译时，uORF 的调控作用则会显著降低；核糖体有可能在 uORF 翻译进程的延伸或终止阶段停滞下来，使后续的mORF得不到翻译[11-12]。
摘要：背景：土壤中的重金属不仅对植物有害，也可通过食物链危害人类和动物的健康。植物对土壤的吸收和解毒是一个精密的调控过程，具有非常复杂的分子生物学机制。重金属转运蛋白在整个调控过程中发挥关键作用，参与了吸收、螯合、区室化和代谢利用等关键步骤。 目的：克隆拟南芥重金属转运蛋白。 方法：本实验以拟南芥为实验材料，提取全长cDNA，并以该cDNA作为模板，采用RT-PCR技术等基因工程及分子生物学手段克隆基因。 结果：成功克隆拟南芥根瘤素MtN21/类EamA转运蛋白家族、类EamA转运蛋白家族、镁转运蛋白6、锌转运体4前体、ABC转运蛋白家族、金属蛋白酶M24家族蛋白、钙调神经磷酸酶类金属磷酸酯酶超家族蛋白等7个转运蛋白基因，这些基因均为重金属转运蛋白基因，为解决重金属污染研究奠定基础。
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关键字:拟南芥；重金属；转运蛋白；基因
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摘要1
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Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1植物材料及处理3
1.1.2菌株与材料3
1.2.3酶与试剂3
1.2方法 3
1.2.1拟南芥总RNA的提取3
1.2.2cDNA的合成3
1.2.3引物的设计及合成4
1.2.4引物最适退火温度的测定4
1.2.5在最适退火温度进行PCR扩增并回收PCR4
1.2.6构建T载体并转化4
1.2.7菌落PCR并测序4
1.2.8构建PFL61-基因质粒5
2结果与分析5
2.1拟南芥基因引物的设计及最适退火温度的测定5
2.1.1拟南芥基因引物的设计结果5
2.1.2最适退火温度的测定5
2.2测序结果6
2.3单酶切构建重组质粒基因结果7
3讨论 8
3.1转运蛋白与重金属污染治理 8
3.2结果展望 9
致谢10
参考文献10
拟南芥重金属转运蛋白的克隆
引言
引言 重金属指比重大于4或5的金属，如镉、铜、铅、铁、镁、锰等，重金属污染的特点有：①污染的范围广②污染的持续时间长③性质稳定[1] ，在环境中不易降解。痕量重金属如Pd、Cr、Cd等可通过“土壤—植物—人体”或“土壤—水—人体”食物链进入人体，破坏正常的生理代谢活动，危害人类健康[2]。土壤重金属污染是指由于人类的活动将重金属带入 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
土壤中，致使土壤重金属含量明显高于其自然背景值，并造成生态破坏和环境质量恶化的现象。随着人口数量的增加，工业规模不断扩大，在农业生产中大量使用化肥农药等，在这些生产活动中的重金属进入土壤系统，形成土壤重金属污染。目前，土壤重金属污染越来越严重，引起全世界范围的关注。土壤重金属污染会抑制微生物活动，无法分解土壤中有毒物质，最终危害人体健康[3-4]。进入20世纪，随着工农业的发展许多种金属污染物通过大气沉降、地矿渗漏及工业废水、生活污水等途径进入土壤，使土壤中富集过多的重金属[5]。有资料表明，我国因重金属污染而导致的经济损失至少200亿元，解决重金属污染问题迫在眉睫[6]。
目前采用的修复方法如物理化学常规方法，不仅昂贵，难以大规模应用，而且常导致土壤结构破坏、肥力下降，降低土地的使用功能和应用价值。以成本低，不破坏土壤和河流生态环境、不引起二次污染等未能特点的植物修复技术正受到学术界的日益密切的关注表现出了广阔的市场前景。目前美国已开始采用荠菜吸收Pb，利用杂交白杨和草类修复重金属污染的土壤。植物修复是利用绿色植物转移、容纳或转化污染使其对环境无害的技术。
其中各种转运蛋白在植物修复中起关键性作用。重金属转运蛋白分为吸收蛋白 ( metal uptake proteins)和排出蛋白(metal efflux proteins)两大类[7]。其中，吸收蛋白主要有：YSL蛋白家族、锌铁蛋白 ( ZIP)家族、天然抗性巨嗜细胞蛋白家族(NRAMP)等，主要位于细胞质膜上，其功能是将重金属转运至细胞质；排出蛋白包括P1B型ATPases、CDF蛋白家族等，其功能是将重金属排出细胞质，或运载至液泡，在植物耐受重金属胁迫中起到积极的防御作用。近年来随着分子生物学等现代技术手段的引入，人们对植物修复过程中金属离子如何进入细胞有了更新的认识。越来越多的修复性蛋白的基因正从植物、微生物和动物中陆续克隆得到。其中存在于生物膜上的各种阳离子转运蛋白在植物修复中起尤为关键的作用。在超富集植物中已经克隆出多个家族的金属运载蛋白基因，这些基因表达出的金属阳离子跨膜运载蛋白可能决定性地参与了重金属在根部的吸收、木质部的装载以及液泡的区室化[8]，在细胞中重金属运输、分布和富集及提高植物抗性方面发挥了极其重要作用。另一方面，一些重金属离子还原酶基因如Hg离子还原酶基因merA、有机汞裂解酶基因merB、Hg转运蛋白基因merT、金属S蛋白基因MTs、植物络合素合成酶基因PCs的发现和克隆为准确了解植物修复的生化及分子机制准备了最基本的条件[9]。
拟南芥（Arabidopsis thaliana）为十字花科（Crucifereae），拟南芥属一年生草本植物。选择它做材料的有点：①具有生长周期短②种子繁殖系数高③易于遗传转化④个体小⑤便于栽培管理等。拟南芥被当做模式植物，广泛应用到植物生物学的各个领域。拟南芥的基因组小，约125Mb，并且其基因组的全序列物理图谱已于2000年12月公布，是本实验的重要实验材料[10]。
载体使用的是PMD-19-T载体，是一种高效克隆PCR产物的专用载体，本载体由pUC19
earch?word=pUC19&fr=qb_search_exp&ie=utf8>载体的多克隆位点
本次试验克隆的基因均有上游开放阅读框（upstream open reading frame，uORF），（表1）是一类短小的开放阅读框（ORF），位于成熟 mRNA 5端非编码区（5-UTR）。在细菌中，uORF 被称为前导肽，影响与氨基酸的合成和运输有关的基因表达。在真核生物中位于信使RNA 5非翻译区域 （5-UTR），调控下游主要开放阅读框ORF（mORF）的翻译。核糖体从mRNA的5端方向滑动扫描uORF起始密码子（uAUG），可能通过重新起始机制继续扫描，识别mORF的起始密码子（mAUG），直到mAUG启动翻译下游mORF，但是，当不能重新起始翻译时，uORF 的调控作用则会显著降低；核糖体有可能在 uORF 翻译进程的延伸或终止阶段停滞下来，使后续的mORF得不到翻译[11-12]。
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