甲硫氨酸亚砜还原酶基因msrb5参与水稻响应铜和甲基紫精诱导的氧化胁迫
甲硫氨酸（Met）作为含硫氨基酸，极易与活性氧发生氧化反应，形成甲硫氨酸亚砜（MetSO），破坏蛋白活性。甲硫氨酸亚砜还原酶（methionine sulfoxide reductase, MSR）能够特异性地将MetSO还原成Met。OsMSRB5基因是水稻OsMSR基因家族中的一员，亚细胞定位结果显示其定位于水稻细胞质中，参与活性氧的清除过程。过量的Cu或联吡啶类除草剂甲基紫精（MV）均可对水稻造成氧化胁迫，影响水稻正常发育。OsMSRB5能在一定程度上能够缓解Cu、MV等对水稻造成的氧化胁迫，对增强水稻耐性具有积极意义。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 OsMSRB5在水稻原生质体中的亚细胞定位3
1.2.1.1水稻材料培育、RNA提取与cDNA的合成 3
1.2.1.2 OsMSRB5的TA克隆3
1.2.1.3载体构建4
1.2.1.4水稻原生质体提取5
1.2.1.5质粒转化水稻原生质体5
1.2.2 OsMSRB5在水稻幼苗中的表达5
1.2.2.1 OsMSRB5基因的组织表达分析6
1.2.2.2 铜、MV处理对水稻叶片中OsMSRB5表达的影响 6
1.2.2.3 铜、MV处理对水稻叶片中OsMSRB5时间梯度表达的影响 7
1.2.3 OsMSRB5蛋白体外酶活测定 7
1.2.4铜、MV处理对水稻生长的影响7
1.2.5铜、MV处理对水稻叶片及根尖过氧化氢积累的影响8
1.2.6铜、MV处理对水稻根尖细胞质膜完整性的影响8
2 结果与分析8
2.1 OsMSRB5在水稻原生质体中的亚细胞定位8
2.2 OsMSRB5在水稻幼苗中的表达8
2.2.1 OsMSRB5基因的组织表达分析8
2.2.2铜处理对水稻叶片OsMSRB5基因表达的影响9 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
2.2.3 MV处理对水稻叶片OsMSRB5基因表达的影响10
2.3 OsMSRB5蛋白体外酶活测定10
2.4 铜、MV处理对水稻生长的影响11
2.5 铜、MV处理对水稻叶片及根尖过氧化氢积累的影响11
2.6 铜、MV处理对水稻根尖细胞质膜完整性的影响12
3 讨论13
4 结论14
致谢15
参考文献16
附录A 溶液配方 17
甲硫氨酸亚砜还原酶基因MSRB5参与水稻响应铜和甲基紫精
诱导的氧化胁迫
引言
引言
细胞内氧分子在接受1电子后转变为超氧阴离子自由基（O2.），超氧阴离子自由基既可与细胞内一些大分子物质直接作用，又可转变为H2O2、羟自由基等，形成活性氧[1]。这些含氧原子能够对部分氨基酸起氧化作用[2]。某些氨基酸的氧化和还原是对蛋白质功能调控的方式之一[3]。活性氧对氨基酸侧链的氧化修饰能够改变蛋白质结构及活性。含硫氨基酸极易被活性氧氧化，甲硫氨酸是四种含硫氨基酸之一，氧化后的甲硫氨酸以甲硫氨酸亚砜（MetSO）形式存在，它的还原由甲硫氨酸亚砜还原酶（Methionine sulfoxide reductase, MSR）进行主导，特异性地将甲硫氨酸亚砜还原成甲硫氨酸，恢复蛋白质正常功能。甲硫氨酸亚砜有MetRSO和MetSSO两种类型，相对应的甲硫氨酸亚砜还原酶可分为甲硫氨酸亚砜还原酶A和甲硫氨酸亚砜还原酶B，分别还原MetRSO和MetSSO[4]。
甲硫氨酸亚砜还原酶A（MSRA）最早于1978年在大肠杆菌中发现[2]，广泛存在于所有原核和真核生物中，主要作用于游离或多肽链中的MetSSO[5]。甲硫氨酸亚砜还原酶B（MSRB）最初于2001年同样从大肠杆菌中发现[6]，作用于游离的或多肽链中的MetRSO。2007年，fRMSR同样在大肠杆菌中被发现， 它能够特异性地催化还原游离的R型甲硫氨酸亚砜[7]。
铜是水稻正常生命活动所必须的微量元素，是多种酶的组分之一，广泛参与如光合等多种生理生化过程。铜具有累积性，过量的铜元素会对水稻造成毒害：过量铜离子破坏植物体内原有的离子平衡，阻碍植物正常的离子吸收、运输过程；过量的铜离子会与核酸、蛋白质等大分子结合，改变生物大分子活性，影响植物体内正常的生理生化反应；重金属离子的积累会产生大量活性氧自由基积聚，引起膜脂过氧化等反应[8]。
甲基紫精（MV）主要成分为11二甲基44二氯化联吡啶嗡，它能够很快地被植物的绿色组织吸收，致其枯死，故又称百草枯，是一种快速灭生性除草剂[9]。联吡啶类除草剂对植物的光合系统有明显的抑制作用。通过高效接收光合作用中电子受体上的电子而形成游离基，游离基经再氧化最终形成超氧物，使得植物细胞中活性氧得以产生并积累[10]，从而对植物产生毒害作用。
水稻OsMSRB家族有3条基因，依次为OsMsrB1、OsMsrB3和OsMSRB5。OsMSRB5是水稻OsMSRB家族基因之一[11]，水稻原生质体中的亚细胞定位研究显示OsMSRB5定位于水稻细胞细胞质中。OsMSRB5参与细胞质中活性氧的清除过程，对铜、MV等对水稻植株造成的氧化胁迫均表现出一定缓解作用，这对于水稻耐性的提升具有积极意义。
材料与方法
材料
选取冬津（DongJin）野生型水稻种子，用10%次氯酸钠溶液暗处浸泡消毒20min，去离子水将次氯酸钠溶液冲净后，种子在30℃温箱环境下于去离子水中浸泡12d至露白（每日更换一次去离子水）。本次水稻培育营养液使用木村B(营养液配方见附录A)，营养液更换频率保持为2日一次。水稻幼苗于生科楼C1003温室生长，温室温度控制在30℃。
1.2方法
1.2. 1 OsMSRB5在水稻原生质体中的亚细胞定位
1. 2. 1. 1 水稻材料培育、RNA提取与cDNA的合成
将DongJin水稻按上述材料培育方法培养至“三叶一心”状态后进行收样。每份样于水稻相同叶片部位称取叶片样0.05g，装入2ml进口离心管中，离心管中预放6颗直径1.5mm钢珠。样品入管后立即放入液氮速冻。使用TAKARA MiniBEST Plant RNA提取试剂盒（编号：9769）进行水稻总RNA的提取。提取后获得的RNA经超微量分光光度计（One DropTM，OD1000+Sepctrophotometer）测定RNA浓度并通过琼脂糖凝胶电泳验证后，使用TAKARA PrimeScript? RT试剂盒（编号：RR047A）进行反转录，合成cDNA作为后续荧光定量模板，最终体系为20μL，20℃冰箱保存备用。（RNA提取及反转录步骤见附录B）
1. 2. 1. 2 OsMSRB5的TA克隆
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 OsMSRB5在水稻原生质体中的亚细胞定位3
1.2.1.1水稻材料培育、RNA提取与cDNA的合成 3
1.2.1.2 OsMSRB5的TA克隆3
1.2.1.3载体构建4
1.2.1.4水稻原生质体提取5
1.2.1.5质粒转化水稻原生质体5
1.2.2 OsMSRB5在水稻幼苗中的表达5
1.2.2.1 OsMSRB5基因的组织表达分析6
1.2.2.2 铜、MV处理对水稻叶片中OsMSRB5表达的影响 6
1.2.2.3 铜、MV处理对水稻叶片中OsMSRB5时间梯度表达的影响 7
1.2.3 OsMSRB5蛋白体外酶活测定 7
1.2.4铜、MV处理对水稻生长的影响7
1.2.5铜、MV处理对水稻叶片及根尖过氧化氢积累的影响8
1.2.6铜、MV处理对水稻根尖细胞质膜完整性的影响8
2 结果与分析8
2.1 OsMSRB5在水稻原生质体中的亚细胞定位8
2.2 OsMSRB5在水稻幼苗中的表达8
2.2.1 OsMSRB5基因的组织表达分析8
2.2.2铜处理对水稻叶片OsMSRB5基因表达的影响9 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
2.2.3 MV处理对水稻叶片OsMSRB5基因表达的影响10
2.3 OsMSRB5蛋白体外酶活测定10
2.4 铜、MV处理对水稻生长的影响11
2.5 铜、MV处理对水稻叶片及根尖过氧化氢积累的影响11
2.6 铜、MV处理对水稻根尖细胞质膜完整性的影响12
3 讨论13
4 结论14
致谢15
参考文献16
附录A 溶液配方 17
甲硫氨酸亚砜还原酶基因MSRB5参与水稻响应铜和甲基紫精
诱导的氧化胁迫
引言
引言
细胞内氧分子在接受1电子后转变为超氧阴离子自由基（O2.），超氧阴离子自由基既可与细胞内一些大分子物质直接作用，又可转变为H2O2、羟自由基等，形成活性氧[1]。这些含氧原子能够对部分氨基酸起氧化作用[2]。某些氨基酸的氧化和还原是对蛋白质功能调控的方式之一[3]。活性氧对氨基酸侧链的氧化修饰能够改变蛋白质结构及活性。含硫氨基酸极易被活性氧氧化，甲硫氨酸是四种含硫氨基酸之一，氧化后的甲硫氨酸以甲硫氨酸亚砜（MetSO）形式存在，它的还原由甲硫氨酸亚砜还原酶（Methionine sulfoxide reductase, MSR）进行主导，特异性地将甲硫氨酸亚砜还原成甲硫氨酸，恢复蛋白质正常功能。甲硫氨酸亚砜有MetRSO和MetSSO两种类型，相对应的甲硫氨酸亚砜还原酶可分为甲硫氨酸亚砜还原酶A和甲硫氨酸亚砜还原酶B，分别还原MetRSO和MetSSO[4]。
甲硫氨酸亚砜还原酶A（MSRA）最早于1978年在大肠杆菌中发现[2]，广泛存在于所有原核和真核生物中，主要作用于游离或多肽链中的MetSSO[5]。甲硫氨酸亚砜还原酶B（MSRB）最初于2001年同样从大肠杆菌中发现[6]，作用于游离的或多肽链中的MetRSO。2007年，fRMSR同样在大肠杆菌中被发现， 它能够特异性地催化还原游离的R型甲硫氨酸亚砜[7]。
铜是水稻正常生命活动所必须的微量元素，是多种酶的组分之一，广泛参与如光合等多种生理生化过程。铜具有累积性，过量的铜元素会对水稻造成毒害：过量铜离子破坏植物体内原有的离子平衡，阻碍植物正常的离子吸收、运输过程；过量的铜离子会与核酸、蛋白质等大分子结合，改变生物大分子活性，影响植物体内正常的生理生化反应；重金属离子的积累会产生大量活性氧自由基积聚，引起膜脂过氧化等反应[8]。
甲基紫精（MV）主要成分为11二甲基44二氯化联吡啶嗡，它能够很快地被植物的绿色组织吸收，致其枯死，故又称百草枯，是一种快速灭生性除草剂[9]。联吡啶类除草剂对植物的光合系统有明显的抑制作用。通过高效接收光合作用中电子受体上的电子而形成游离基，游离基经再氧化最终形成超氧物，使得植物细胞中活性氧得以产生并积累[10]，从而对植物产生毒害作用。
水稻OsMSRB家族有3条基因，依次为OsMsrB1、OsMsrB3和OsMSRB5。OsMSRB5是水稻OsMSRB家族基因之一[11]，水稻原生质体中的亚细胞定位研究显示OsMSRB5定位于水稻细胞细胞质中。OsMSRB5参与细胞质中活性氧的清除过程，对铜、MV等对水稻植株造成的氧化胁迫均表现出一定缓解作用，这对于水稻耐性的提升具有积极意义。
材料与方法
材料
选取冬津（DongJin）野生型水稻种子，用10%次氯酸钠溶液暗处浸泡消毒20min，去离子水将次氯酸钠溶液冲净后，种子在30℃温箱环境下于去离子水中浸泡12d至露白（每日更换一次去离子水）。本次水稻培育营养液使用木村B(营养液配方见附录A)，营养液更换频率保持为2日一次。水稻幼苗于生科楼C1003温室生长，温室温度控制在30℃。
1.2方法
1.2. 1 OsMSRB5在水稻原生质体中的亚细胞定位
1. 2. 1. 1 水稻材料培育、RNA提取与cDNA的合成
将DongJin水稻按上述材料培育方法培养至“三叶一心”状态后进行收样。每份样于水稻相同叶片部位称取叶片样0.05g，装入2ml进口离心管中，离心管中预放6颗直径1.5mm钢珠。样品入管后立即放入液氮速冻。使用TAKARA MiniBEST Plant RNA提取试剂盒（编号：9769）进行水稻总RNA的提取。提取后获得的RNA经超微量分光光度计（One DropTM，OD1000+Sepctrophotometer）测定RNA浓度并通过琼脂糖凝胶电泳验证后，使用TAKARA PrimeScript? RT试剂盒（编号：RR047A）进行反转录，合成cDNA作为后续荧光定量模板，最终体系为20μL，20℃冰箱保存备用。（RNA提取及反转录步骤见附录B）
1. 2. 1. 2 OsMSRB5的TA克隆
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