水稻钾转运体oshakb的转运活性鉴定
钾对植物生长发育起关键作用，广泛参与各种生理生化过程。HAK/KUP/KT家族是水稻中最大的钾离子转运蛋白家族， OsHAKb是水稻HAK/KUP/KT家族成员，前期研究结果表明其功能缺失突变体对低钾胁迫更加敏感，但是其转运体活性并不明确。因此，本研究着重利用酵母、细菌和非洲爪蟾卵母细胞等多个实验系统来解析OsHAKb的转运体活性。初步结果表明，OsHAKb在细菌和非洲卵母细胞中具备一定的钾吸收活性。本研究有助于进一步解析OsHAKb的生理功能和作用机制。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 3
1.2.1构建载体3
1.2.2酵母异源表达系统4
1.2.3细菌异源表达系统5
1.2.4蛙卵异源表达系统5
1.2.5拟南芥异源表达系统6
2结果与分析7
2.1 OsHAKb在酵母异源系统中的功能分析7
2.2 OsHAKb在细菌异源系统中的功能分析7
2.3 OsHAKb在蛙卵异源系统中的功能分析9
2.4 OsHAKb在拟南芥异源系统中的活性检验9
3讨论9
致谢10
参考文献10
水稻钾转运体OsHAKb的转运活性鉴定
引言
引言
当植物在生长发育过程中钾供给不足时，就会出现明显的缺钾症状，表现为茎秆柔弱而易倒伏；叶片容易失水，耐旱性和耐寒性降低； 蛋白质和叶绿素被分解，叶色发黄，进而导致整体植株死亡。耕地土壤中缺钾会导致农业产品产量和质量出现明显滑坡。钾离子在植物生长发育过程中具有重要作用。K+能激活超过50种关键的代谢酶类，包括那些参与光合作用、氧化代谢以及蛋白合成的酶[1]。K+被认为是一类电荷平衡离子并且对于所有类型的植物运动是不可少的，包括气孔张开。另外，K+能为大多数酶促反应提供最佳酸碱水平(pH~7.2) ，并中和大分子阴离子[2]。因此，提高作物产量的重中之重是追寻如何提高植物的钾转运能力。
根 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
据细菌KUP(K+ uptake)和真菌HAK(High Affinity K+)的同源性[3][4]，植物HAK/KUP/KT首次从小麦和模式植物拟南芥中克隆出来。HAK/KUP/KT钾转运体基因存在于所有已知的植物基因组中，但不存在于动物细胞中[5]。HAK/KUP/KT家族成员的晶体结构尚无报道。HAK/KUP/KT钾转运体属于转运氨基酸多胺金属阳离子的APC家族转运体，其运输方式为次级主动转运，其广泛存在于细菌、真菌和植物中。细菌中的研究表明，HAK/KUP/KT钾转运体为H+和K+的同向转运体，但是植物中还没有明确报道。
植物对不同K+供应环境的适应依赖于K+吸收和转运系统的微调。K+转运蛋白的转录调控是不同植物物种对K+缺陷胁迫响应的通用机制[5]。一个典型的例子是属于第一类的HAK/KUP/KT运输机的规定。如AtHAK5，HvHAK1，OsHAK1，OsHAK5，CaHAK1，LeHAK5和ThHAK5所示，这些基因在根和芽中在对照条件下表现出低的表达水平，并且在K+饥饿时在根中高度上调[4,6,7, 913]。
酵母是一种简单的真核单细胞生物，因其细胞机构简单，可以作为一种简单有效且快速的模式生物，利用酵母细胞特定元素吸收缺陷或敏感型酵母突变体，可以探究钾转运功能基因的功能。
非洲爪蟾卵母细胞（Xenopus Oocyte）是一个和酵母细胞类似的广泛应用于生物学研究的异源表达体系。目前，在对各种离子通道功能鉴定的研究中，已经广泛了应用这种异源表达系统。与其他异源系统相比，非洲爪蟾卵母细胞具有一些优缺点，优点是卵母细胞易于获取，操作比较方便，同时也有缺点，卵母细胞的状态会随爪蟾的状态而变化，不同批次的爪蟾和细胞差异也会造成实验误差，此外实验时温度也会影响蛋白的正常表达，从而影响实验结果。
大肠杆菌TK2420突变体菌株由于缺失了三个钾吸收基因，因此丧失了转运钾离子的功能，该异源系统和酵母相类似。
本论文前期研究发现，OsHAKb功能缺失突变体变现出低钾敏感表型，并且冠部钾含量明显高于野生型，为探索该转运蛋白的转运活性，利用了酵母、细菌、爪蟾、拟南芥这四个不同的异源系统对OsHAKb钾转运蛋白的功能进行初步研究。这一研究将为解析OsHAKb的生理功能和作用机制提供重要依据。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株与载体
酵母菌株：CY162（MATα, Δtrk1, trk2::pCK64, his3, leu2, ura3, trp1, and ade2）。
大肠杆菌：E.coli（DH5α）为本实验室保存菌株。
E. coli TK2420 (ΔKdp, Kup, Trk)
农杆菌： GV3101为实验室保存菌株
载体： pYES2（实验室保存）。
p1307Flag
pEASYBlunt E2(购买于全式金公司)
1．1．2 动植物材料
动物材料：非洲爪蟾卵母细胞
植物材料：拟南芥（athak5）
1．1．3 培养基
LB培养基：2.5 g Yeast extract，5 g Tryptone，5 g NaCl，用超纯水定容至500 mL，高压蒸汽灭菌，121°C ，20 min。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 3
1.2.1构建载体3
1.2.2酵母异源表达系统4
1.2.3细菌异源表达系统5
1.2.4蛙卵异源表达系统5
1.2.5拟南芥异源表达系统6
2结果与分析7
2.1 OsHAKb在酵母异源系统中的功能分析7
2.2 OsHAKb在细菌异源系统中的功能分析7
2.3 OsHAKb在蛙卵异源系统中的功能分析9
2.4 OsHAKb在拟南芥异源系统中的活性检验9
3讨论9
致谢10
参考文献10
水稻钾转运体OsHAKb的转运活性鉴定
引言
引言
当植物在生长发育过程中钾供给不足时，就会出现明显的缺钾症状，表现为茎秆柔弱而易倒伏；叶片容易失水，耐旱性和耐寒性降低； 蛋白质和叶绿素被分解，叶色发黄，进而导致整体植株死亡。耕地土壤中缺钾会导致农业产品产量和质量出现明显滑坡。钾离子在植物生长发育过程中具有重要作用。K+能激活超过50种关键的代谢酶类，包括那些参与光合作用、氧化代谢以及蛋白合成的酶[1]。K+被认为是一类电荷平衡离子并且对于所有类型的植物运动是不可少的，包括气孔张开。另外，K+能为大多数酶促反应提供最佳酸碱水平(pH~7.2) ，并中和大分子阴离子[2]。因此，提高作物产量的重中之重是追寻如何提高植物的钾转运能力。
根 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
据细菌KUP(K+ uptake)和真菌HAK(High Affinity K+)的同源性[3][4]，植物HAK/KUP/KT首次从小麦和模式植物拟南芥中克隆出来。HAK/KUP/KT钾转运体基因存在于所有已知的植物基因组中，但不存在于动物细胞中[5]。HAK/KUP/KT家族成员的晶体结构尚无报道。HAK/KUP/KT钾转运体属于转运氨基酸多胺金属阳离子的APC家族转运体，其运输方式为次级主动转运，其广泛存在于细菌、真菌和植物中。细菌中的研究表明，HAK/KUP/KT钾转运体为H+和K+的同向转运体，但是植物中还没有明确报道。
植物对不同K+供应环境的适应依赖于K+吸收和转运系统的微调。K+转运蛋白的转录调控是不同植物物种对K+缺陷胁迫响应的通用机制[5]。一个典型的例子是属于第一类的HAK/KUP/KT运输机的规定。如AtHAK5，HvHAK1，OsHAK1，OsHAK5，CaHAK1，LeHAK5和ThHAK5所示，这些基因在根和芽中在对照条件下表现出低的表达水平，并且在K+饥饿时在根中高度上调[4,6,7, 913]。
酵母是一种简单的真核单细胞生物，因其细胞机构简单，可以作为一种简单有效且快速的模式生物，利用酵母细胞特定元素吸收缺陷或敏感型酵母突变体，可以探究钾转运功能基因的功能。
非洲爪蟾卵母细胞（Xenopus Oocyte）是一个和酵母细胞类似的广泛应用于生物学研究的异源表达体系。目前，在对各种离子通道功能鉴定的研究中，已经广泛了应用这种异源表达系统。与其他异源系统相比，非洲爪蟾卵母细胞具有一些优缺点，优点是卵母细胞易于获取，操作比较方便，同时也有缺点，卵母细胞的状态会随爪蟾的状态而变化，不同批次的爪蟾和细胞差异也会造成实验误差，此外实验时温度也会影响蛋白的正常表达，从而影响实验结果。
大肠杆菌TK2420突变体菌株由于缺失了三个钾吸收基因，因此丧失了转运钾离子的功能，该异源系统和酵母相类似。
本论文前期研究发现，OsHAKb功能缺失突变体变现出低钾敏感表型，并且冠部钾含量明显高于野生型，为探索该转运蛋白的转运活性，利用了酵母、细菌、爪蟾、拟南芥这四个不同的异源系统对OsHAKb钾转运蛋白的功能进行初步研究。这一研究将为解析OsHAKb的生理功能和作用机制提供重要依据。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株与载体
酵母菌株：CY162（MATα, Δtrk1, trk2::pCK64, his3, leu2, ura3, trp1, and ade2）。
大肠杆菌：E.coli（DH5α）为本实验室保存菌株。
E. coli TK2420 (ΔKdp, Kup, Trk)
农杆菌： GV3101为实验室保存菌株
载体： pYES2（实验室保存）。
p1307Flag
pEASYBlunt E2(购买于全式金公司)
1．1．2 动植物材料
动物材料：非洲爪蟾卵母细胞
植物材料：拟南芥（athak5）
1．1．3 培养基
LB培养基：2.5 g Yeast extract，5 g Tryptone，5 g NaCl，用超纯水定容至500 mL，高压蒸汽灭菌，121°C ，20 min。
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