苯胺双加氧酶基因簇的鉴定
苯胺双加氧酶基因簇的鉴定[20200614171902]
摘要：苯胺及其衍生物广泛应用于工业生产，是重要的环境污染物。而微生物是消除这些污染物的主力军。本实验室分离筛选到一株取代脲类除草剂降解菌株Sphingobium sp. YBL2。利用 RT-PCR和启动子标记两种方法初步研究了该基因簇的转录调控机制。结果证明该基因簇为组成型表达，其中R基因负责调控作用。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
关键字:Sphingobiumsp.YBL2；苯胺双加氧酶基因簇；转录调控机制
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 试剂与培养基 2
1.2供试菌株与质粒4
1.3 YBL2菌株制备4
1.4菌株基因组DNA提取5
1.5 YBL2诱导培养5
1.6RT-PCR5
1.6.1 RNA提取5
1.6.2 逆转录5
1.6.3 PCR扩增5
1.6.4 PCR产物TA克隆6
1.6.5 酶连产物转化6
1.6.6 测序比对6
1.7 苯胺双加氧酶基因簇启动子的PCR扩增6
1.7.1 PCR扩增6
1.7.2 PCR产物TA克隆以及酶连产物的转化7
1.8 pKP302启动子替换7
1.8.1 启动子片段与pKP302质粒的双酶切回收7
1.8.2 酶切产物的酶连、转化与筛选7
1.8.3 三亲结合7
1.9 β-半乳糖苷酶活检测7
2结果与分析8
2.1RT-PCR电泳检测结果 8
2.2pKP302启动子替换8
2.3 苯胺诱导对启动子表达的影响10
3讨论12
致谢12
参考文献12苯胺双加氧酶基因簇的鉴定
引言
1.苯胺及其衍生物的简介
1.1类化合物的理化性质
苯胺(Aniline)俗称阿尼林油，分子式为C6H5NH2（如图1），相对分子量 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
aidu.com/view/1120817.htm>为93.128，是一种无色、油状、可燃且具有高毒性的液体，遇到光和空气颜色会变深，具有类似腐蛋的臭味。苯胺是芳香族化合物，呈弱碱性，微溶于水，溶于乙醚、乙醇、苯等有机溶剂。
图1
1.2苯胺的用途
苯胺是一种重要的化工原料，广泛应用于国防、印染、塑料、油漆、农药和医药工业[1]。随着化工工业的不断发展，对于苯胺的使用量也在逐年增加，我国已经成为全球最大的苯胺生产国[2]。
1.3苯胺的危害
苯胺及其衍生物是农药生产中的重要原料。然而，苯胺类除草剂在被大量使用而进入环境中以后，能够通过多种途径被降解成苯胺类化合物及其它代谢产物，这些苯胺类化合物亦为重要的化学工业原料和中间体[3]。苯胺类化合物是一类严重污染环境和危害人体健康的有害物质。苯胺可侵入人体与血红蛋白结合，使血红蛋白与氧气的结合能力下降，造成机体组织缺氧，损害机体器官[4] 。而且其中许多种类为具有“致癌、致畸、致突变”的三致物质，对环境构成严重污染[5-6]，引起了世界各国的广泛关注，已经成为环境保护的一大难题。
2.微生物降解苯胺的研究现状
由于苯胺及其衍生物可对环境造成严重污染，同时严重危害人类健康，因此苯胺降解的研究引起了世界各国政府和科学家的高度重视[7]。
相较于物理和化学方法，运用微生物降解苯胺具有速度快、消耗低、反应条件温和以及无二次污染等显著优点，因此，利用微生物技术处理苯胺类污染物已经成为目前重要的研究途径和研究方向[8]。
2.1 降解苯胺类化合物的微生物资源
目前，国内外学者已对苯胺的微生物降解展开了大量的研究工作，从长期受苯胺污染的土壤中分离筛选出苯胺降解菌。这些菌株分别属于假单胞菌属[9-11]、红球菌属[12]、诺卡(氏)菌属[11]、代尔夫特氏菌属[13-14]、不动杆菌属[15]、产碱杆菌属[16]、弗拉托菌属[17]、莫拉菌属[18]等。
2.2苯胺的微生物降解机理及途径
微生物降解苯胺主要有好氧降解和厌氧降解两种途径。在好氧条件下，苯胺在双加氧条件下转化为邻苯二酚，这是整个降解过程中最关键的一步，但目前仅有少数几个典型的苯胺降解菌株的苯胺双加氧酶基因簇得到了克隆研究[19-12]。可通过邻位、间位两种代谢途径被降解[3,23,24,25]。
在厌氧条件，苯胺可以在硫酸盐的还原条件下[26]或是在硝酸根的还原条件下[27]，生成4-氨基苯甲酸盐，然后通过4-aminoben-zoyl-CoA氨基苯甲酰辅酶去氨基，生成苯酰，然后再进一步代谢分解[28]。
2.3 苯胺降解菌的降解基因簇研究
通过研究发现，苯胺降解菌中与苯胺降解有关的基因紧密相连、成簇排列。该基因簇能彻底将苯胺转化为三羧酸循环的中间代谢产物。好氧菌中苯胺双加氧酶能将苯胺转化成为邻苯二酚，是苯胺降解过程的第一步，也是整个降解过程最关键的一步，但与其相关的研究较少，目前仅有少数几个典型的苯胺降解菌株的苯胺双加氧酶基因簇得到了克隆研究。
几种常见类型的调控蛋白结构示意图如下图2。从图中可以看出，调控蛋白一般由2部分组成，其中一端与信号分子结合，接受外部 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
调控，而另一端含有DNA结合域，调控基因的表达。
图2 常见的调控蛋白结构示意图
林敏等的研究发现Delftia tsuruhatensis AD9中苯胺双加氧酶基因簇tad(如图3)，其启动子激活依赖于tadR和苯胺的存在。其中，苯胺为信号分子与tadR结合后调控启动子的表达，其调控方式为正调控。
图3 Delftia tsuruhatensis AD9苯胺双加氧酶基因簇示意图
而菌株YBL2中（如图4），调控蛋白AdoR仅有一个结合域与信号分子结合，缺少DNA结合域。调控蛋白不全导致其无法被外部信号如苯胺等诱导，其具体的调控功能目前尚不清楚。
图4 YBL2苯胺降解基因簇示意图
1 材料与方法
1.1 试剂与培养基
抗生素：先用去离子水配制100 μg/mL的氨苄青霉素和链霉素，再用水相滤膜过滤除菌，-20℃保存。
LB培养基：酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，去离子水1000 mL，pH 7.0。培养基中添加的抗生素浓度：氨苄青霉素(Amp) 100 mg/L、庆大霉素(Gm) 30 mg/L、卡那霉素(Kan) 50 mg/L、氯霉素(Cm) 20 mg/L。
R2A培养基：酵母粉 0.5 g，蛋白胨 0.5 g，干酪素 0.5 g，可溶性淀粉 0.2 g，丙酮酸钠 0.3 g，KH2PO4 0.3 g，MgSO4 0.05 g，去离子水1000 mL，pH 7.0。
液体培养基加入15 g/L琼脂粉配制成固体培养基。
苯胺母液：将2 g苯胺完全溶解于100 ml乙腈中，用0.22 μm的有机相滤膜过滤除菌，配制成20 g/L的苯胺母液，使用时取适量的母液稀释到培养基中。
表1 本研究中使用的菌株和质粒
菌株和质粒 性质 来源
菌株：
Sphingobium sp. YBL2 野生菌株，G-，StrR，苯胺降解 本实验室保存
摘要：苯胺及其衍生物广泛应用于工业生产，是重要的环境污染物。而微生物是消除这些污染物的主力军。本实验室分离筛选到一株取代脲类除草剂降解菌株Sphingobium sp. YBL2。利用 RT-PCR和启动子标记两种方法初步研究了该基因簇的转录调控机制。结果证明该基因簇为组成型表达，其中R基因负责调控作用。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
关键字:Sphingobiumsp.YBL2；苯胺双加氧酶基因簇；转录调控机制
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 试剂与培养基 2
1.2供试菌株与质粒4
1.3 YBL2菌株制备4
1.4菌株基因组DNA提取5
1.5 YBL2诱导培养5
1.6RT-PCR5
1.6.1 RNA提取5
1.6.2 逆转录5
1.6.3 PCR扩增5
1.6.4 PCR产物TA克隆6
1.6.5 酶连产物转化6
1.6.6 测序比对6
1.7 苯胺双加氧酶基因簇启动子的PCR扩增6
1.7.1 PCR扩增6
1.7.2 PCR产物TA克隆以及酶连产物的转化7
1.8 pKP302启动子替换7
1.8.1 启动子片段与pKP302质粒的双酶切回收7
1.8.2 酶切产物的酶连、转化与筛选7
1.8.3 三亲结合7
1.9 β-半乳糖苷酶活检测7
2结果与分析8
2.1RT-PCR电泳检测结果 8
2.2pKP302启动子替换8
2.3 苯胺诱导对启动子表达的影响10
3讨论12
致谢12
参考文献12苯胺双加氧酶基因簇的鉴定
引言
1.苯胺及其衍生物的简介
1.1类化合物的理化性质
苯胺(Aniline)俗称阿尼林油，分子式为C6H5NH2（如图1），相对分子量
aidu.com/view/1120817.htm>为93.128，是一种无色、油状、可燃且具有高毒性的液体，遇到光和空气颜色会变深，具有类似腐蛋的臭味。苯胺是芳香族化合物，呈弱碱性，微溶于水，溶于乙醚、乙醇、苯等有机溶剂。
图1
1.2苯胺的用途
苯胺是一种重要的化工原料，广泛应用于国防、印染、塑料、油漆、农药和医药工业[1]。随着化工工业的不断发展，对于苯胺的使用量也在逐年增加，我国已经成为全球最大的苯胺生产国[2]。
1.3苯胺的危害
苯胺及其衍生物是农药生产中的重要原料。然而，苯胺类除草剂在被大量使用而进入环境中以后，能够通过多种途径被降解成苯胺类化合物及其它代谢产物，这些苯胺类化合物亦为重要的化学工业原料和中间体[3]。苯胺类化合物是一类严重污染环境和危害人体健康的有害物质。苯胺可侵入人体与血红蛋白结合，使血红蛋白与氧气的结合能力下降，造成机体组织缺氧，损害机体器官[4] 。而且其中许多种类为具有“致癌、致畸、致突变”的三致物质，对环境构成严重污染[5-6]，引起了世界各国的广泛关注，已经成为环境保护的一大难题。
2.微生物降解苯胺的研究现状
由于苯胺及其衍生物可对环境造成严重污染，同时严重危害人类健康，因此苯胺降解的研究引起了世界各国政府和科学家的高度重视[7]。
相较于物理和化学方法，运用微生物降解苯胺具有速度快、消耗低、反应条件温和以及无二次污染等显著优点，因此，利用微生物技术处理苯胺类污染物已经成为目前重要的研究途径和研究方向[8]。
2.1 降解苯胺类化合物的微生物资源
目前，国内外学者已对苯胺的微生物降解展开了大量的研究工作，从长期受苯胺污染的土壤中分离筛选出苯胺降解菌。这些菌株分别属于假单胞菌属[9-11]、红球菌属[12]、诺卡(氏)菌属[11]、代尔夫特氏菌属[13-14]、不动杆菌属[15]、产碱杆菌属[16]、弗拉托菌属[17]、莫拉菌属[18]等。
2.2苯胺的微生物降解机理及途径
微生物降解苯胺主要有好氧降解和厌氧降解两种途径。在好氧条件下，苯胺在双加氧条件下转化为邻苯二酚，这是整个降解过程中最关键的一步，但目前仅有少数几个典型的苯胺降解菌株的苯胺双加氧酶基因簇得到了克隆研究[19-12]。可通过邻位、间位两种代谢途径被降解[3,23,24,25]。
在厌氧条件，苯胺可以在硫酸盐的还原条件下[26]或是在硝酸根的还原条件下[27]，生成4-氨基苯甲酸盐，然后通过4-aminoben-zoyl-CoA氨基苯甲酰辅酶去氨基，生成苯酰，然后再进一步代谢分解[28]。
2.3 苯胺降解菌的降解基因簇研究
通过研究发现，苯胺降解菌中与苯胺降解有关的基因紧密相连、成簇排列。该基因簇能彻底将苯胺转化为三羧酸循环的中间代谢产物。好氧菌中苯胺双加氧酶能将苯胺转化成为邻苯二酚，是苯胺降解过程的第一步，也是整个降解过程最关键的一步，但与其相关的研究较少，目前仅有少数几个典型的苯胺降解菌株的苯胺双加氧酶基因簇得到了克隆研究。
几种常见类型的调控蛋白结构示意图如下图2。从图中可以看出，调控蛋白一般由2部分组成，其中一端与信号分子结合，接受外部 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
调控，而另一端含有DNA结合域，调控基因的表达。
图2 常见的调控蛋白结构示意图
林敏等的研究发现Delftia tsuruhatensis AD9中苯胺双加氧酶基因簇tad(如图3)，其启动子激活依赖于tadR和苯胺的存在。其中，苯胺为信号分子与tadR结合后调控启动子的表达，其调控方式为正调控。
图3 Delftia tsuruhatensis AD9苯胺双加氧酶基因簇示意图
而菌株YBL2中（如图4），调控蛋白AdoR仅有一个结合域与信号分子结合，缺少DNA结合域。调控蛋白不全导致其无法被外部信号如苯胺等诱导，其具体的调控功能目前尚不清楚。
图4 YBL2苯胺降解基因簇示意图
1 材料与方法
1.1 试剂与培养基
抗生素：先用去离子水配制100 μg/mL的氨苄青霉素和链霉素，再用水相滤膜过滤除菌，-20℃保存。
LB培养基：酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，去离子水1000 mL，pH 7.0。培养基中添加的抗生素浓度：氨苄青霉素(Amp) 100 mg/L、庆大霉素(Gm) 30 mg/L、卡那霉素(Kan) 50 mg/L、氯霉素(Cm) 20 mg/L。
R2A培养基：酵母粉 0.5 g，蛋白胨 0.5 g，干酪素 0.5 g，可溶性淀粉 0.2 g，丙酮酸钠 0.3 g，KH2PO4 0.3 g，MgSO4 0.05 g，去离子水1000 mL，pH 7.0。
液体培养基加入15 g/L琼脂粉配制成固体培养基。
苯胺母液：将2 g苯胺完全溶解于100 ml乙腈中，用0.22 μm的有机相滤膜过滤除菌，配制成20 g/L的苯胺母液，使用时取适量的母液稀释到培养基中。
表1 本研究中使用的菌株和质粒
菌株和质粒 性质 来源
菌株：
Sphingobium sp. YBL2 野生菌株，G-，StrR，苯胺降解 本实验室保存
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