氢气促进拟南芥根生长发育的分子机制初探氢气促进拟南芥根生长发育的分子机制初探(附件)【字数：6360】
氢气 (hydrogen, H2)是一种新的气体信号分子，但是不清楚植物氢气的产生途径。前文已经发现H2可以调控植物生长发育，但是一直不清楚相关的机理。针对上述科学问题，本研究以转莱茵衣藻 (Chlamydomonas?reinhardtii)氢酶HYD1 (iron hydrogenase1)基因的拟南芥过表达株系为材料，通过表型分析和分子生物学技术来探查相关的机理。实验首先发现，与野生型拟南芥相比，3个过表达株系的主根和侧根发生呈现明显增强趋势；定量PCR的结果发现，过表达株系根组织中ATX1 (Arabidopsis homolog of trithorax1)、pICDH (peroxisomal NADP-dependent isocitrate dehydrogenase)、CS4 (Citrate Synthase 4)和G6PD6 (glucose 6-phosphate dehydrogenase 6)基因的表达被明显诱导，暗示氢气促进拟南芥根生长发育可能与其可促进细胞伸长、能量代谢和维持氧化还原平衡有关。总之，本研究初步探索了氢气促进拟南芥根生长发育的分子机制，从而为尝试改良作物品质和推动氢农业发展提供了初步的理论支持。
目录
摘要 1
关键词 1
ABSTRACT 1
KEY WORDS 1
引言 1
1 材料与方法 4
1.1 材料培养 4
1.2 提取根的总RNA 4
1.3 RNA反转录 5
1.4 荧光定量PCR 5
1.5 根长的测量 6
1.6 试剂 6
1.7 数据分析 6
2 结果与分析 6
2.1 氢酶促进拟南芥根生长及侧根发生 6
2.2 相对基因表达水平 7
3 讨论 7
致谢 9
参考文献 9
氢气促进拟南芥根生长发育的分子机制初探
生命基地151 王俊杰
引言
引言
氢气作为可燃气体被人熟知。过去氢气被认为无生物活性。近年来，随着对氢气生物学功能的研究，氢气被认为是一个新的气体 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
信号分子。研究表明，氢气对人的多种疾病有治疗效果[1]。氢气不仅在医学上发挥重要作用，而且对植物的生长产生不可忽视的影响。氢气能促进植物抵抗生物胁迫。番茄果实的多酚氧化酶活性和一氧化氮含量被氢气处理提高了，从而番茄对黑霉菌的抗性增加了[2]。氢气还参与了植物对非生物胁迫的耐受，非生物胁迫如干旱胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和重金属胁迫等。富氢水处理的拟南芥幼苗的气孔开度减小，幼苗的抗旱性被增强[3]。氢气和一氧化碳增强了黄瓜的抗旱性，黄瓜中水溶性碳水化合物、总可溶性蛋白质和脯氨酸的含量增加了[4]。氢气可通过上调锌指转录因子ZAT10/12来提高拟南芥的耐盐性[5]。氢气通过调控苜蓿中黄酮类物质的代谢来提高其对紫外线诱导的氧化损伤的耐受性。外源氢气处理的苜蓿对百草枯诱导的氧化胁迫具有更强的耐受性。氢气处理的苜蓿中脂质过氧化水平、过氧化氢含量和超氧阴离子自由基水平降低 [6]。氢气的抗氧化胁迫作用是由血红素加氧酶1介导的，因为血红素加氧酶1的抑制剂抵消了氢气的作用。氢气参与了植物对重金属胁迫的耐受。铝 (aluminum, Al)毒性的最早和明显症状之一是抑制根伸长。苜蓿幼苗暴露于铝胁迫或一氧化氮释放化合物硝普钠 (sodium nitroprusside, SNP)不仅增加了NO的产生，而且还导致根伸长受到显著抑制[7]。50％富氢水 (hydrogenrich water, HRW)的预处理显著缓解了上述抑制效应。类似于HRW，NO清除剂可以降低NO产生并减轻Al或SNP诱导的根生长受抑制。因此，HRW通过减少NO产生来减轻Al对苜蓿根伸长的抑制[7]。HRW预处理降低了苜蓿中的镉积累。10％HRW处理可显著降低镉胁迫引起的硫代巴比妥酸活性物质 (thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)的含量，这抑制了镉毒性症状的出现。这些反应与代表性抗氧化酶和其同工酶活性的显著增加有关[8]。
根系在植物获取养分和水分中发挥重要作用，而氢气能明显促进植物的主根伸长。研究表明，50％富氢水显著增加了黄瓜的主根长[9]。植物的侧根参与营养和水分的吸收，而氢气参与了植物侧根生长发育的调控。研究表明，生长素诱导拟南芥产生的氢气参与了幼苗侧根的发生。类似地，萘乙酸 (Naphthalene1acetic acid, NAA)也能够在番茄幼苗中引发内源性氢气的产生。生长素转运抑制剂N1萘基酞酸 (N1naphthyphthalamic acid, NPA)可抑制氢气的产生，然后可通过外源施加的氢气挽救侧根发育。NAA和氢气处理的番茄幼苗的NO水平增加。此外，NO的清除抑制了由生长素和氢气诱导的侧根形成[10]。分子证据证实，一些代表性的NO靶向细胞周期调控基因也被氢气诱导，但是可通过去除内源性NO而解除诱导效应。遗传证据表明，在氢气的存在下，拟南芥硝酸还原酶突变体表现出侧根长度的缺陷。总之，生长素诱导的氢气产生与侧根形成有关，至少部分地通过硝酸还原酶依赖的NO合成[10]。氢气还参与调控植物不定根发育。植物不定根的发育对植物无性繁殖具有重要意义。氢气可促进干旱胁迫下黄瓜不定根的发生，这与一氧化碳的产生有关[4]。
尽管氢气的生物学效应被不断发现，但氢气调控植物生长发育的分子机制仍未完全探明。又因为根对植物生长发育至关重要，所以本研究将利用氢酶过表达拟南芥对氢气调控拟南芥根生长发育的分子机制进行进一步探索。本研究采用的氢酶来源于莱茵衣藻。HYD1利用还原型铁氧还原蛋白和NADH催化氢离子产生氢气。因为表观遗传、氮同化、三羧酸循环和磷酸戊糖途径对细胞的生长发育有着重要作用，所以本研究选择这四个方面来初步探索氢气调控拟南芥根生长发育的分子机制。
植物通过激活信号传导途径来响应外部刺激，信号传导途径将快速改变参与响应的基因的表达模式。调节基因表达的分子机制部分取决于染色质的结构，这决定了DNA的转录机制。染色质修饰的机制包括非编码RNA、组蛋白变异、组蛋白修饰和DNA甲基化的变化，这些均可参与植物对环境刺激的响应。组蛋白氨基末端尾部的化学修饰可以募集特定的转录因子或诱导核小体重塑以促进RNA聚合酶II (RNA Polymerase II, Pol II)介导的转录。Trithorax 1的拟南芥同源物 (Arabidopsis homolog of trithorax1, ATX1)作为组蛋白甲基转移酶可三甲基化组蛋白H3的第4位赖氨酸,形成H3K4me3。基因ATX1的功能丧失导致拟南芥的发芽率降低，气孔孔径增大[11]。基因ATX1突变体拟南芥蒸腾更快，并且对脱水胁迫的耐受性降低。这种缺陷是由于基因NCED3的转录水平降低导致的ABA生物合成减少，基因NCED3编码产生ABA的关键酶。脱水胁迫增强ATX1结合并激活基因NCED3，其机制是ATX1提高与基因NCED3结合的RNA聚合酶II的量。通过上调基因NCED3转录和ABA产生，ATX1影响ABA调节的途径和基因[11]。ATX1可与三个ATX1调节的基因的启动子和+300bp区域结合。ATX1在促进启动子的TATA结合蛋白 (TATA binding protein, TBP)和RNA聚合酶II募集以及转录区域内的H3K4三甲基化中表现出两种不同的作用[12]。基因NCED3很好地证明了ATX1的两种不同作用。ATX1被磷酸化形式的Pol II募集到转录序列的+300bp区域，其中它使核小体三甲基化。抑制Pol II的C末端结构域的磷酸化降低了在+300bp区域结合的H3K4me3和ATX1的量[13]。抑制剂Flavopiridol (Flap)显著降低与基因NCED3结合的Pol II的C末端域上第5位丝氨酸的磷酸化水平，这导致ATX1和H3K4me3水平在+300bp区域降低。然而，在NCED3启动子处TBP和ATX1水平没有改变[12]。在Flap处理的样品中产生几乎正常水平的NCED3转录物，这与ATX1突变体中NCED3转录物减少约80％相反。因此，NCED3表达强烈依赖于其启动子处的ATX1占据，但不依赖于ATX1在+300bp区域的存在[12]。在+300bp区域缺乏ATX1导致了该区域中H3K4me3的缺失。这表明ATX1在调节转录中的功能作用可与其在H3K4三甲基化中的作用分开。此外，ATX1还调控植物的成花转变。在ATX1突变体中，成花抑制因子FLOWERING LOCUS C (FLC)表达水平降低。FLC的下调加速了拟南芥从营养生长向生殖发育的转变。ATX1在开花前直接结合FLC基因座并上调FLC的表达，并在转变为开花时释放[14]。ATX1具有众多的植物学效应，然而ATX1与氢气参与的调控网络之间的关系并不明确，所以本研究对此进行初步探索。
目录
摘要 1
关键词 1
ABSTRACT 1
KEY WORDS 1
引言 1
1 材料与方法 4
1.1 材料培养 4
1.2 提取根的总RNA 4
1.3 RNA反转录 5
1.4 荧光定量PCR 5
1.5 根长的测量 6
1.6 试剂 6
1.7 数据分析 6
2 结果与分析 6
2.1 氢酶促进拟南芥根生长及侧根发生 6
2.2 相对基因表达水平 7
3 讨论 7
致谢 9
参考文献 9
氢气促进拟南芥根生长发育的分子机制初探
生命基地151 王俊杰
引言
引言
氢气作为可燃气体被人熟知。过去氢气被认为无生物活性。近年来，随着对氢气生物学功能的研究，氢气被认为是一个新的气体 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
信号分子。研究表明，氢气对人的多种疾病有治疗效果[1]。氢气不仅在医学上发挥重要作用，而且对植物的生长产生不可忽视的影响。氢气能促进植物抵抗生物胁迫。番茄果实的多酚氧化酶活性和一氧化氮含量被氢气处理提高了，从而番茄对黑霉菌的抗性增加了[2]。氢气还参与了植物对非生物胁迫的耐受，非生物胁迫如干旱胁迫、盐胁迫、氧化胁迫和重金属胁迫等。富氢水处理的拟南芥幼苗的气孔开度减小，幼苗的抗旱性被增强[3]。氢气和一氧化碳增强了黄瓜的抗旱性，黄瓜中水溶性碳水化合物、总可溶性蛋白质和脯氨酸的含量增加了[4]。氢气可通过上调锌指转录因子ZAT10/12来提高拟南芥的耐盐性[5]。氢气通过调控苜蓿中黄酮类物质的代谢来提高其对紫外线诱导的氧化损伤的耐受性。外源氢气处理的苜蓿对百草枯诱导的氧化胁迫具有更强的耐受性。氢气处理的苜蓿中脂质过氧化水平、过氧化氢含量和超氧阴离子自由基水平降低 [6]。氢气的抗氧化胁迫作用是由血红素加氧酶1介导的，因为血红素加氧酶1的抑制剂抵消了氢气的作用。氢气参与了植物对重金属胁迫的耐受。铝 (aluminum, Al)毒性的最早和明显症状之一是抑制根伸长。苜蓿幼苗暴露于铝胁迫或一氧化氮释放化合物硝普钠 (sodium nitroprusside, SNP)不仅增加了NO的产生，而且还导致根伸长受到显著抑制[7]。50％富氢水 (hydrogenrich water, HRW)的预处理显著缓解了上述抑制效应。类似于HRW，NO清除剂可以降低NO产生并减轻Al或SNP诱导的根生长受抑制。因此，HRW通过减少NO产生来减轻Al对苜蓿根伸长的抑制[7]。HRW预处理降低了苜蓿中的镉积累。10％HRW处理可显著降低镉胁迫引起的硫代巴比妥酸活性物质 (thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)的含量，这抑制了镉毒性症状的出现。这些反应与代表性抗氧化酶和其同工酶活性的显著增加有关[8]。
根系在植物获取养分和水分中发挥重要作用，而氢气能明显促进植物的主根伸长。研究表明，50％富氢水显著增加了黄瓜的主根长[9]。植物的侧根参与营养和水分的吸收，而氢气参与了植物侧根生长发育的调控。研究表明，生长素诱导拟南芥产生的氢气参与了幼苗侧根的发生。类似地，萘乙酸 (Naphthalene1acetic acid, NAA)也能够在番茄幼苗中引发内源性氢气的产生。生长素转运抑制剂N1萘基酞酸 (N1naphthyphthalamic acid, NPA)可抑制氢气的产生，然后可通过外源施加的氢气挽救侧根发育。NAA和氢气处理的番茄幼苗的NO水平增加。此外，NO的清除抑制了由生长素和氢气诱导的侧根形成[10]。分子证据证实，一些代表性的NO靶向细胞周期调控基因也被氢气诱导，但是可通过去除内源性NO而解除诱导效应。遗传证据表明，在氢气的存在下，拟南芥硝酸还原酶突变体表现出侧根长度的缺陷。总之，生长素诱导的氢气产生与侧根形成有关，至少部分地通过硝酸还原酶依赖的NO合成[10]。氢气还参与调控植物不定根发育。植物不定根的发育对植物无性繁殖具有重要意义。氢气可促进干旱胁迫下黄瓜不定根的发生，这与一氧化碳的产生有关[4]。
尽管氢气的生物学效应被不断发现，但氢气调控植物生长发育的分子机制仍未完全探明。又因为根对植物生长发育至关重要，所以本研究将利用氢酶过表达拟南芥对氢气调控拟南芥根生长发育的分子机制进行进一步探索。本研究采用的氢酶来源于莱茵衣藻。HYD1利用还原型铁氧还原蛋白和NADH催化氢离子产生氢气。因为表观遗传、氮同化、三羧酸循环和磷酸戊糖途径对细胞的生长发育有着重要作用，所以本研究选择这四个方面来初步探索氢气调控拟南芥根生长发育的分子机制。
植物通过激活信号传导途径来响应外部刺激，信号传导途径将快速改变参与响应的基因的表达模式。调节基因表达的分子机制部分取决于染色质的结构，这决定了DNA的转录机制。染色质修饰的机制包括非编码RNA、组蛋白变异、组蛋白修饰和DNA甲基化的变化，这些均可参与植物对环境刺激的响应。组蛋白氨基末端尾部的化学修饰可以募集特定的转录因子或诱导核小体重塑以促进RNA聚合酶II (RNA Polymerase II, Pol II)介导的转录。Trithorax 1的拟南芥同源物 (Arabidopsis homolog of trithorax1, ATX1)作为组蛋白甲基转移酶可三甲基化组蛋白H3的第4位赖氨酸,形成H3K4me3。基因ATX1的功能丧失导致拟南芥的发芽率降低，气孔孔径增大[11]。基因ATX1突变体拟南芥蒸腾更快，并且对脱水胁迫的耐受性降低。这种缺陷是由于基因NCED3的转录水平降低导致的ABA生物合成减少，基因NCED3编码产生ABA的关键酶。脱水胁迫增强ATX1结合并激活基因NCED3，其机制是ATX1提高与基因NCED3结合的RNA聚合酶II的量。通过上调基因NCED3转录和ABA产生，ATX1影响ABA调节的途径和基因[11]。ATX1可与三个ATX1调节的基因的启动子和+300bp区域结合。ATX1在促进启动子的TATA结合蛋白 (TATA binding protein, TBP)和RNA聚合酶II募集以及转录区域内的H3K4三甲基化中表现出两种不同的作用[12]。基因NCED3很好地证明了ATX1的两种不同作用。ATX1被磷酸化形式的Pol II募集到转录序列的+300bp区域，其中它使核小体三甲基化。抑制Pol II的C末端结构域的磷酸化降低了在+300bp区域结合的H3K4me3和ATX1的量[13]。抑制剂Flavopiridol (Flap)显著降低与基因NCED3结合的Pol II的C末端域上第5位丝氨酸的磷酸化水平，这导致ATX1和H3K4me3水平在+300bp区域降低。然而，在NCED3启动子处TBP和ATX1水平没有改变[12]。在Flap处理的样品中产生几乎正常水平的NCED3转录物，这与ATX1突变体中NCED3转录物减少约80％相反。因此，NCED3表达强烈依赖于其启动子处的ATX1占据，但不依赖于ATX1在+300bp区域的存在[12]。在+300bp区域缺乏ATX1导致了该区域中H3K4me3的缺失。这表明ATX1在调节转录中的功能作用可与其在H3K4三甲基化中的作用分开。此外，ATX1还调控植物的成花转变。在ATX1突变体中，成花抑制因子FLOWERING LOCUS C (FLC)表达水平降低。FLC的下调加速了拟南芥从营养生长向生殖发育的转变。ATX1在开花前直接结合FLC基因座并上调FLC的表达，并在转变为开花时释放[14]。ATX1具有众多的植物学效应，然而ATX1与氢气参与的调控网络之间的关系并不明确，所以本研究对此进行初步探索。
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