水稻孢粉素合成关键酶的克隆及活性测定水稻孢粉素合成关键酶的克隆及活性测定(附件)【字数：5498】
花粉壁可以起到保护花粉的作用而孢粉素是花粉壁的重要组成部分。为了研究水稻中孢粉素合成的过程，本文通过构建 GST 载体成功克隆TKPR1、PKS2和ACOS12 基因，在进行原核表达并且纯化之后通过质谱进行底物的测定，证明了在水稻中以上三个基因合成的蛋白在孢粉素合成过程中有关键作用。基因ACOS12表达蛋白将羟基酸反应生成软脂酰辅酶A，软脂酰辅酶A和丙二酰辅酶A在PKS2表达蛋白催化下生成多聚吡喃酮，最后由多聚α-吡喃酮还原酶TKPR1催化生成孢粉素前体，此次发现有助于了解水稻孢粉素合成的过程以及其中关键酶的作用。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）5
1.材料与方法5
1.1水稻品种和菌株5
1.2 TKPR1、PKS2和ACOS12基因的扩增5
1.3表达载体的构建5
1.4蛋白的表达和提纯7
1.5不连续SDSPAGE8
1.6质谱检测反应产物9
2结果与分析9
2.1表达载体的构建9
2.2 蛋白表达和提纯 12
2.3质谱检测反应产物12
3讨论13
致谢13
参考文献14
水稻孢粉素合成关键酶的克隆及活性测定
生命基地151 丁宇
引言
引言
花粉壁起到了保护花粉的作用，同时也能促进柱头和花粉识别受精[1]。作为花粉外壁外层的主要成分，孢粉素具有相当强的化学稳定性，还能够抵抗酶和化学试剂的降解。因此他被认为是保护花粉不受外界环境和生物胁迫的最重要的屏障[2]。同时孢粉素在授粉和萌发过程中有着特异的作用[3]。相关研究表明了孢粉素是生物聚合物的混合物，通过酯键和醚键偶联，主要含有长链脂肪酸、苯丙素、酚类和类胡萝卜素[4]。花粉外壁内层也曾经被认为是孢粉素，然而研究表明花粉外壁内层的核心成分还是阿拉伯半乳糖蛋白与糖蛋白 [5]并且对花粉内壁的形成起到了维护和模板作用[6]。 TKPR1、PKS2和ACOS12是水稻孢粉素合成关键酶相关基因，本课题将研究其在孢粉素合成中所催化 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
的反应以及对于相应底物的酶活性。
孢粉素成分的合成从起始到最终聚合的过程需要多个共同酶的参与[7]。孢粉素脂肪酸的从头合成经研究表明发生在绒毡层的质体中[8]。乙酰辅酶A被脂肪酶合成酶催化后经过缩合、还原、脱水、还原过程形成了软脂酸。其后可以形成硬脂酸或者在内质网上被催化[9]。拟南芥孢粉素相关已经研较为透彻。在拟南芥中，孢粉素通过大约八个基因调控的通路来合成。拟南芥中与孢粉素相关的基因MALE STERILITY(MS2)在绒毡层中表达，编码一种脂肪酸还原酶，可以催化六碳脂肪醜基载体蛋白（Fatty AcylACP）产生一种脂肪醇。在水稻中，有相关研究显示，水稻中Defective Pollen Wall（DPW）基因编码的脂肪酰基载体蛋白还原酶和MS2功能相似，DPW和MS2都是在绒毡层中表达，所以说DPW和MS2可能是同源基因，在脂肪醇合成中有很重要的作用。
MALE STERILITY188 (MS188) 和它上游直接调控因子ABORTED MICROSPORES (AMS)是绒毡层发育的两个重要的转录因子。所有孢粉素合成蛋白都特异地在绒毡层中表达，并且被分泌进入另外的小室。 MS188,在绒毡层中表达的MYB转录家族的转录因子，直接调控POLYKETIDE SYNTHASE A (PKSA), PKSB, MALE STERILE2 (MS2), and a CYTOCHROME P450 gene (CYP703A2)这些基因。与之相对的是，CYP704B1, ACYLCOA SYNTHETASE5 (ACOS5), TETRAKETIDE aPYRONE REDUCTASE1 (TKPR1) 和TKPR2的表达在ams突变体中大量较少，但是在ms188突变体中却没有影响。但是是MS188而不是AMS可以激活CYP704B1 、ACOS5和TKPR1的表达,。在ms188突变体中，MS188同源物的主要抑制减少了这些基因的表达，这表示MS188以及其他MYB家族的成员起到了减少这些基因表达的作用。当MS188被减少了，在ams突变体中，一些孢粉素合成基因的表达也减少了。因此，MS188是激活孢粉素合成的主要调控因子，而且，AMS和MS188可能形成一个前馈环孢粉素生物合成途径的激活了快速花粉壁的形成。
研究普遍认为，酯酰辅酶A被查尔酮合成酶家族成员PKSA与PKSB催化加工生成多聚吡喃酮，然后细胞色素羟化酶家族成员对多聚吡喃酮进行加工，其产物经由多聚吡喃酮还原酶家族成员催化最终生成孢粉素单体物质。 另外一条合成途径是由乙酰辅酶A直接催化形成丙二酰辅酶A，然后通过PKSA与PKSB加工形成类黄酮，类黄酮最后转换为孢粉素[10]。
图一 拟南芥和水稻中孢粉素合成途径
整个合成过程在是绒毡层中完成的，而脂肪酸和CoA在ACOS5的催化下形成脂肪酰CoA，然后在PKSA/PKSB酶的催化下，和丙二酰CoA缩合并且扩展成为三酮和四酮化合物。PKS酶可以直接延伸成为脂肪酰CoA,也可以通过CYP450进行羟基化后再进行延伸[11]。
TKPR1、PKS2和，ACOS12是水稻孢粉素合成关键酶相关基因[12]，其在拟南芥中的同源基因表达的蛋白参与到孢粉素的合成途径中[13]。为探究水稻中这三种基因在孢粉素合成过程中的作用，本文用宁粳4号野生型水稻cDNA作为模板扩增 TKPR1、PKS2和ACOS12 基因，插入到GST 载体并将它们导入 E.coil BL21(DE3)进行原核表达，纯化后经过SDSPAGE检测结果，之后通过反应后进行质谱检测，鉴定这三种基因表达的蛋白是否具有酶活。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）5
1.材料与方法5
1.1水稻品种和菌株5
1.2 TKPR1、PKS2和ACOS12基因的扩增5
1.3表达载体的构建5
1.4蛋白的表达和提纯7
1.5不连续SDSPAGE8
1.6质谱检测反应产物9
2结果与分析9
2.1表达载体的构建9
2.2 蛋白表达和提纯 12
2.3质谱检测反应产物12
3讨论13
致谢13
参考文献14
水稻孢粉素合成关键酶的克隆及活性测定
生命基地151 丁宇
引言
引言
花粉壁起到了保护花粉的作用，同时也能促进柱头和花粉识别受精[1]。作为花粉外壁外层的主要成分，孢粉素具有相当强的化学稳定性，还能够抵抗酶和化学试剂的降解。因此他被认为是保护花粉不受外界环境和生物胁迫的最重要的屏障[2]。同时孢粉素在授粉和萌发过程中有着特异的作用[3]。相关研究表明了孢粉素是生物聚合物的混合物，通过酯键和醚键偶联，主要含有长链脂肪酸、苯丙素、酚类和类胡萝卜素[4]。花粉外壁内层也曾经被认为是孢粉素，然而研究表明花粉外壁内层的核心成分还是阿拉伯半乳糖蛋白与糖蛋白 [5]并且对花粉内壁的形成起到了维护和模板作用[6]。 TKPR1、PKS2和ACOS12是水稻孢粉素合成关键酶相关基因，本课题将研究其在孢粉素合成中所催化 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
的反应以及对于相应底物的酶活性。
孢粉素成分的合成从起始到最终聚合的过程需要多个共同酶的参与[7]。孢粉素脂肪酸的从头合成经研究表明发生在绒毡层的质体中[8]。乙酰辅酶A被脂肪酶合成酶催化后经过缩合、还原、脱水、还原过程形成了软脂酸。其后可以形成硬脂酸或者在内质网上被催化[9]。拟南芥孢粉素相关已经研较为透彻。在拟南芥中，孢粉素通过大约八个基因调控的通路来合成。拟南芥中与孢粉素相关的基因MALE STERILITY(MS2)在绒毡层中表达，编码一种脂肪酸还原酶，可以催化六碳脂肪醜基载体蛋白（Fatty AcylACP）产生一种脂肪醇。在水稻中，有相关研究显示，水稻中Defective Pollen Wall（DPW）基因编码的脂肪酰基载体蛋白还原酶和MS2功能相似，DPW和MS2都是在绒毡层中表达，所以说DPW和MS2可能是同源基因，在脂肪醇合成中有很重要的作用。
MALE STERILITY188 (MS188) 和它上游直接调控因子ABORTED MICROSPORES (AMS)是绒毡层发育的两个重要的转录因子。所有孢粉素合成蛋白都特异地在绒毡层中表达，并且被分泌进入另外的小室。 MS188,在绒毡层中表达的MYB转录家族的转录因子，直接调控POLYKETIDE SYNTHASE A (PKSA), PKSB, MALE STERILE2 (MS2), and a CYTOCHROME P450 gene (CYP703A2)这些基因。与之相对的是，CYP704B1, ACYLCOA SYNTHETASE5 (ACOS5), TETRAKETIDE aPYRONE REDUCTASE1 (TKPR1) 和TKPR2的表达在ams突变体中大量较少，但是在ms188突变体中却没有影响。但是是MS188而不是AMS可以激活CYP704B1 、ACOS5和TKPR1的表达,。在ms188突变体中，MS188同源物的主要抑制减少了这些基因的表达，这表示MS188以及其他MYB家族的成员起到了减少这些基因表达的作用。当MS188被减少了，在ams突变体中，一些孢粉素合成基因的表达也减少了。因此，MS188是激活孢粉素合成的主要调控因子，而且，AMS和MS188可能形成一个前馈环孢粉素生物合成途径的激活了快速花粉壁的形成。
研究普遍认为，酯酰辅酶A被查尔酮合成酶家族成员PKSA与PKSB催化加工生成多聚吡喃酮，然后细胞色素羟化酶家族成员对多聚吡喃酮进行加工，其产物经由多聚吡喃酮还原酶家族成员催化最终生成孢粉素单体物质。 另外一条合成途径是由乙酰辅酶A直接催化形成丙二酰辅酶A，然后通过PKSA与PKSB加工形成类黄酮，类黄酮最后转换为孢粉素[10]。
图一 拟南芥和水稻中孢粉素合成途径
整个合成过程在是绒毡层中完成的，而脂肪酸和CoA在ACOS5的催化下形成脂肪酰CoA，然后在PKSA/PKSB酶的催化下，和丙二酰CoA缩合并且扩展成为三酮和四酮化合物。PKS酶可以直接延伸成为脂肪酰CoA,也可以通过CYP450进行羟基化后再进行延伸[11]。
TKPR1、PKS2和，ACOS12是水稻孢粉素合成关键酶相关基因[12]，其在拟南芥中的同源基因表达的蛋白参与到孢粉素的合成途径中[13]。为探究水稻中这三种基因在孢粉素合成过程中的作用，本文用宁粳4号野生型水稻cDNA作为模板扩增 TKPR1、PKS2和ACOS12 基因，插入到GST 载体并将它们导入 E.coil BL21(DE3)进行原核表达，纯化后经过SDSPAGE检测结果，之后通过反应后进行质谱检测，鉴定这三种基因表达的蛋白是否具有酶活。
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