水稻原生质体中cam过表达增强抗氧化酶活性
：实验以徐稻四号作为材料，探究钙调素基因CaM1-1和CaM1-2是否参与ABA诱导的抗氧化防护途径。钙调素基因编码钙调素蛋白，钙调素做为植物细胞中Ca2+信号的解码器，在植物接受外界信号中具有无可替代的地位。然而CaM是否参与ABA诱导的抗氧化防护途径并未报道。本文利用水稻原生质体瞬时表达体系过表达CaM1-1和CaM1-2，检测ABA处理后原生质体内的抗氧化防护酶SOD和APX的活性。实验结果显示CaM1-1和CaM1-2都能提高ABA信号途径中SOD和APX的活性。说明CaM1-1和CaM1-2参与ABA诱导抗氧化防护途径。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1cDNA制备，植物材料培养与处理2
1.2.2大提质粒2
1.2.3质粒与基因连接3
1.2.4感受态制备和转化3
1.2.5原生质体制备和质粒转入3
1.2.6抗氧化防护酶活力测定3
2结果与分析4
2.1原生质体RNA质量检测4
2.2瞬时表达载体的电泳鉴定4
2.3CaM参与ABA诱导的抗坏血酸APX活性的影响 5
3讨论 6
致谢7
参考文献7
图21 原生质体RNA质量检测4
图22 重组原生质体瞬时表达载体CaM11检验4
图23 重组原生质体瞬时表达载体CaM12酶切检验5
图24 CaM参与ABA诱导的抗氧化酶SOD活性的上调6
图25 CaM参与ABA诱导的抗坏血酸APX活性的上调6
水稻原生质体中CaM过表达增强抗氧化酶活性
引言
引言
植物激素脱落酸（ABA）作为一种能引起芽休眠、叶子脱落和抑制细胞生长等生理作用的植物激素，能够调节多种植物生长发育过程。一般来说，干旱、寒冷、高温、盐渍和水分胁迫等都能使植物体内ABA迅速增加， ABA的积累刺激气孔关闭，
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
调节基因表达，诱导渗透调节物质的积累以及上调抗氧化防护系统，从而增强植物抵抗环境胁迫的能力。(Hu XL et al.2007)在ABA的信号转导过程中，Ca2+离子具有重要作用，它与活性氧，NO，蛋白激酶以及其它转录因子之间形成了一个复杂有序的网络调控系。(Sang J et al.2008,Bright J et al.2006)
钙离子作为第二信使, 在植物的生长、发育以及抗逆性等方面都起到了极为重要的作用。(S PheanOPas et al 2005)ABA等都能使Ca2+瞬时提高。细胞提供一系列的钙离子结合蛋白（CBPs）来作为钙离子的受体。CBPs通过构象上的转变来结合钙离子，引起的下游的一系列的反应的。Ca2+的结合蛋白有钙调素（CaM）、钙依赖型激酶（CDPK）以及钙调磷酸酶B（CBL）。(S Yano et al.1998,孙 1995)而在真核生物中CaM是一种研究的最清楚的Ca2+受体。大量研究显示CaM参与植物生长发育的调控以及植物对各种环境刺激的反应（Harper et al.,2004;Bouche et al.,2005）。CaM是一类较小的酸性蛋白，有较灵活的结合钙离子的两个EFhands的球状区域。CaM本身并无催化活性，其介导的信号转导和生理反应必须通过受调节的CaM结合蛋白(CalmodulinBinding Proteins, CaMBPs)来实现。(Yang T,et al 2003)CBK作为一种感知Ca2+/CaM的分子参与多种胁迫诱导的信号转导途径。有报道称（CBK）诱导了ABA诱导的气孔关闭过程。ABA可以诱导拟南芥和紫花苜蓿中类似结合CaM受体的细胞质激酶（CRCK1）基因的表达和含量的（Yang et al. ,2004）。CaM结合蛋白可以参与ABA信号途径，那么CaM是否也参与ABA信号途径？实验室前期的工作基础显示水稻中的CaM11和CaM12受ABA诱导表达。说明水稻中CaM参与ABA信号途径。
ABA作为一种内源保护激素提高了植物相关抗氧化防护酶的活性。研究表明玉米叶片中ABA能够提高抗氧防护酶SOD、APX、CAT、GR的活性。（Jiang and Zhang，2004）。Sarika等（2005）发现在小麦幼苗中，ABA同样能够增加SOD 、CAT、APX的活性。这说明了ABA能够提高植物体内抗氧化防护系统的能力。实验室前期的工作基础显示Ca2+/CaM依赖型蛋白激酶参与ABA诱导的抗氧化防护系统，调控抗氧化防护酶活性的增加。那么CaM是否也同样参与了CaABA诱导的抗氧化防护系统？
本实验利用水稻原生质体瞬时表达体系，(秦 2012)表达了水稻CaM11和CaM12，检测转化后的水稻原生质体内的抗氧化防护酶SOD和CAT的活性。实验结果显示，过表达CaM11和CaM12均能提高SOD和CAT的酶活性。CaM12能大量的提高SOD和CAT 的活性。从而作为CaM参与ABA诱导的抗氧化防护途径的证据之一。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 试剂 纤维素酶，离析酶，甘露醇，B巯基乙醇，BSA，ddH2O,氯化钙，MES，pcr试剂盒（10xbuffer，dNTP,Mg2+,特定引物，Taq酶），LB培养基培养液和LB选择性培养基，甘油，K2HPO4,KH2PO4，EDTA,PVP,抗坏血酸Asc，考蓝，H2O2，APx底物，Met,NBT,核黄素，EDTA,NADPH,GSSG,大提质粒试剂盒，乙醇，异丙醇，NaCl,PEG8000,饱和酚，氯仿
1．1．2 仪器 PCR仪，大型离心机，小型离心机，水浴锅，无菌操作台，高压灭菌锅，制冰机，大型摇床，分光光度计，研胚，显微镜，冰箱冰柜，光照培养箱，细菌恒温培养箱，涡旋仪。
1．2 实验方法
1. 2. 1 cDNA制备（实验室前期工作），获得钙调素基因克隆,并进行植物材料培养与处理
构建载体：将水稻基因组的mRNA提出，并反转成cDNA，设计特定基因的引物克隆目的基因，将目的基因连接到载体上，冷冻保存.
植物材料培养处理：①以徐稻4号黄化苗为实验材料。
②取饱满一致的水稻种子10%次氯酸钠消毒15min，自来水冲洗3次，浸种催芽，均匀撒播，用浸湿的滤纸铺盖，黑暗处理，在28℃植物培养箱中水培。
③挑出生长态势良好且一致的幼苗接种于下端统一剪出切口的96空白，光照培养箱28℃培养，备用。
1. 2. 2 大提质粒，并4度冷冻保存，备用（参照分子克隆手册)
①将培养好的含所需质粒的大肠杆菌培养液，用标准碱裂解法提取质粒。所得DNA溶液即为质粒粗提液。
②使用无水乙醇沉淀得到质粒DNA的絮状沉淀，用TE溶解质粒DNA沉淀，并取少量稀释一定倍数测OD值，得到质粒DNA的浓度，并用OD260/OD280的比值检验其纯度，确认没有蛋白质和RNA的污染。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1cDNA制备，植物材料培养与处理2
1.2.2大提质粒2
1.2.3质粒与基因连接3
1.2.4感受态制备和转化3
1.2.5原生质体制备和质粒转入3
1.2.6抗氧化防护酶活力测定3
2结果与分析4
2.1原生质体RNA质量检测4
2.2瞬时表达载体的电泳鉴定4
2.3CaM参与ABA诱导的抗坏血酸APX活性的影响 5
3讨论 6
致谢7
参考文献7
图21 原生质体RNA质量检测4
图22 重组原生质体瞬时表达载体CaM11检验4
图23 重组原生质体瞬时表达载体CaM12酶切检验5
图24 CaM参与ABA诱导的抗氧化酶SOD活性的上调6
图25 CaM参与ABA诱导的抗坏血酸APX活性的上调6
水稻原生质体中CaM过表达增强抗氧化酶活性
引言
引言
植物激素脱落酸（ABA）作为一种能引起芽休眠、叶子脱落和抑制细胞生长等生理作用的植物激素，能够调节多种植物生长发育过程。一般来说，干旱、寒冷、高温、盐渍和水分胁迫等都能使植物体内ABA迅速增加， ABA的积累刺激气孔关闭，
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
调节基因表达，诱导渗透调节物质的积累以及上调抗氧化防护系统，从而增强植物抵抗环境胁迫的能力。(Hu XL et al.2007)在ABA的信号转导过程中，Ca2+离子具有重要作用，它与活性氧，NO，蛋白激酶以及其它转录因子之间形成了一个复杂有序的网络调控系。(Sang J et al.2008,Bright J et al.2006)
钙离子作为第二信使, 在植物的生长、发育以及抗逆性等方面都起到了极为重要的作用。(S PheanOPas et al 2005)ABA等都能使Ca2+瞬时提高。细胞提供一系列的钙离子结合蛋白（CBPs）来作为钙离子的受体。CBPs通过构象上的转变来结合钙离子，引起的下游的一系列的反应的。Ca2+的结合蛋白有钙调素（CaM）、钙依赖型激酶（CDPK）以及钙调磷酸酶B（CBL）。(S Yano et al.1998,孙 1995)而在真核生物中CaM是一种研究的最清楚的Ca2+受体。大量研究显示CaM参与植物生长发育的调控以及植物对各种环境刺激的反应（Harper et al.,2004;Bouche et al.,2005）。CaM是一类较小的酸性蛋白，有较灵活的结合钙离子的两个EFhands的球状区域。CaM本身并无催化活性，其介导的信号转导和生理反应必须通过受调节的CaM结合蛋白(CalmodulinBinding Proteins, CaMBPs)来实现。(Yang T,et al 2003)CBK作为一种感知Ca2+/CaM的分子参与多种胁迫诱导的信号转导途径。有报道称（CBK）诱导了ABA诱导的气孔关闭过程。ABA可以诱导拟南芥和紫花苜蓿中类似结合CaM受体的细胞质激酶（CRCK1）基因的表达和含量的（Yang et al. ,2004）。CaM结合蛋白可以参与ABA信号途径，那么CaM是否也参与ABA信号途径？实验室前期的工作基础显示水稻中的CaM11和CaM12受ABA诱导表达。说明水稻中CaM参与ABA信号途径。
ABA作为一种内源保护激素提高了植物相关抗氧化防护酶的活性。研究表明玉米叶片中ABA能够提高抗氧防护酶SOD、APX、CAT、GR的活性。（Jiang and Zhang，2004）。Sarika等（2005）发现在小麦幼苗中，ABA同样能够增加SOD 、CAT、APX的活性。这说明了ABA能够提高植物体内抗氧化防护系统的能力。实验室前期的工作基础显示Ca2+/CaM依赖型蛋白激酶参与ABA诱导的抗氧化防护系统，调控抗氧化防护酶活性的增加。那么CaM是否也同样参与了CaABA诱导的抗氧化防护系统？
本实验利用水稻原生质体瞬时表达体系，(秦 2012)表达了水稻CaM11和CaM12，检测转化后的水稻原生质体内的抗氧化防护酶SOD和CAT的活性。实验结果显示，过表达CaM11和CaM12均能提高SOD和CAT的酶活性。CaM12能大量的提高SOD和CAT 的活性。从而作为CaM参与ABA诱导的抗氧化防护途径的证据之一。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 试剂 纤维素酶，离析酶，甘露醇，B巯基乙醇，BSA，ddH2O,氯化钙，MES，pcr试剂盒（10xbuffer，dNTP,Mg2+,特定引物，Taq酶），LB培养基培养液和LB选择性培养基，甘油，K2HPO4,KH2PO4，EDTA,PVP,抗坏血酸Asc，考蓝，H2O2，APx底物，Met,NBT,核黄素，EDTA,NADPH,GSSG,大提质粒试剂盒，乙醇，异丙醇，NaCl,PEG8000,饱和酚，氯仿
1．1．2 仪器 PCR仪，大型离心机，小型离心机，水浴锅，无菌操作台，高压灭菌锅，制冰机，大型摇床，分光光度计，研胚，显微镜，冰箱冰柜，光照培养箱，细菌恒温培养箱，涡旋仪。
1．2 实验方法
1. 2. 1 cDNA制备（实验室前期工作），获得钙调素基因克隆,并进行植物材料培养与处理
构建载体：将水稻基因组的mRNA提出，并反转成cDNA，设计特定基因的引物克隆目的基因，将目的基因连接到载体上，冷冻保存.
植物材料培养处理：①以徐稻4号黄化苗为实验材料。
②取饱满一致的水稻种子10%次氯酸钠消毒15min，自来水冲洗3次，浸种催芽，均匀撒播，用浸湿的滤纸铺盖，黑暗处理，在28℃植物培养箱中水培。
③挑出生长态势良好且一致的幼苗接种于下端统一剪出切口的96空白，光照培养箱28℃培养，备用。
1. 2. 2 大提质粒，并4度冷冻保存，备用（参照分子克隆手册)
①将培养好的含所需质粒的大肠杆菌培养液，用标准碱裂解法提取质粒。所得DNA溶液即为质粒粗提液。
②使用无水乙醇沉淀得到质粒DNA的絮状沉淀，用TE溶解质粒DNA沉淀，并取少量稀释一定倍数测OD值，得到质粒DNA的浓度，并用OD260/OD280的比值检验其纯度，确认没有蛋白质和RNA的污染。
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