水稻耐盐基因mybc与泛素e3连接酶(osmsrfp)互作验证及功能的初步探究
植物因其固定不动的特性比动物更易受环境因素的影响[1]。盐害、水分和温度已成为全球作物的三大环境危害因素。水稻中的HKT转运体/离子通道家族在Na+耐受机制中发挥重要作用[2]。前期研究发现一类新的MYB-CC类转录因子（命名为OsMYBc）可以和OsHKT1;1基因启动子区域结合，发挥正调控作用。为进一步完善调控网络，前期研究中利用酵母双杂系统，以MYBc N端肽段为钓饵蛋白筛选到与OsMYBc互作的蛋白RING型泛素E3连接酶，将其命名为OsMSRFP（Oryza sativa MYBc-Stress-related RING Finger Protein）。在本研究中，我们使用细胞生物学，分子生物学和生物化学方法，证明OsMSRFP和OsMYBc间确实存在相互作用。OsMSRFP可泛素化其底物OsMYBc，互作后增强了OsHKT1;1基因启动子活性，提高植物耐盐性。总体而言，OsMSRFP/OsMYBc复合物通过转录调节途径在植物抵御盐胁迫中起重要作用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.1.1植物材料 3
1.1.2菌株、载体3
1.1.3主要试剂和试剂盒 3
1.2研究方法3
1.2.1烟草瞬时表达方法3
1.2.2 GUS活性测定3
1.2.3质粒提取方法3
1.2.4 GST标签蛋白原核表达及纯化3
1.2.5免疫印迹（western blot）检测3
1.2.6点突变实验3
1.2.7双分子荧光互补BiFC3
1.2.8 GST Pull Down4
1.2.9 95体外泛素化试验4
1.2.10数据分析4
2结果与分析4
2.1OsMSRFP泛素E3连接酶活性验证4
2.2OsMSRFP定位于细胞边缘和细胞核4
2.3GST Pull Down证实OsMSRFP是OsMYBc的互作蛋白5
2.4体内Os *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
MYBc和OsMSRFP存在相互关联6
2.5OsMYBc是OsMSRFP的反应底物7
2.6OsMSRFP和OsMYBc互作后对OsHKT1;1起正调控作用8
3结论与讨论9
3.1OsMYBc与OsMSRFP互作且正向调控OsHKT1;1转录9
3.2蛋白质泛素化结果讨论9
致谢10
参考文献10
水稻耐盐基因MYBc与泛素E3连接酶（OsMSRFP）互作验证及功能的初步研究
引言
植物因其固定不动的特性比动物更易受环境因素的影响[1]。盐害、水分和温度已成为全球作物的三大环境危害因素。土壤盐渍化是世界范围内面临的环境问题，全世界约8千万公顷的土地遭受盐渍化的侵蚀，中国盐渍土分布广、类型多，总面积约1亿hm2是制约农业生产的重要因素。
生理研究表明植物盐分胁迫是多因素的，包括渗透胁迫和细胞钠（Na+）毒性[3]。当植物体内的盐离子积累到一定程度，离子毒害开始显现，包括细胞膜完整性被破坏；胞内蛋白质失活影响胞内的酶反应，其中以光合过程对盐度最敏感；蛋白质合成受抑制；胞内Na+/K+平衡被打破[4]等。
虽然高盐浓度抑制植物生长，但在植物体内有一套适应或者抵御Na+积累的措施和途径，或将Na+排出细胞外至质外体或土壤中[57]，或是螯合胞质中的Na+以隔离在液泡中[8]，或是减少Na+从根部向地上部的运输，或是增强地上部Na+向地下部回流[911]。要完成这些生理过程需要Na+通道蛋白和转运载体的参与和相互配合。
最近的研究表明，HKT转运体/离子通道家族在植物Na+耐受机制中起重要作用[2]。HKT转运蛋白可以依据对Na+和K+的离子渗透性分为两类：I类HKT转运蛋白（HKT1s）通常介导Na+的选择性转运，而II类HKT转运蛋白（HKT2）部分介导Na+/K+转运活性[12,13]。拟南芥，水稻和小麦中I类HKT转运蛋白可从叶子排出Na+，从木质部汁液中除去Na+[1518]，以保护植物叶和光合机械免于Na+过度积累的危害，提高植物Na+耐受性[11,14]。
但目前尚未在植物中发现HKT转运蛋白的调节剂[2]。考虑到基因转录水平的调节对植物抵御胁迫的生理调节有重要意义，实验室团队用Clontech的酵母单杂交系统Matchmaker Gold Yeast OneHybrid Library Screening System筛选cDNA文库中与启动子区域结合的转录因子，发现MYBcc家族的蛋白可以与OsHKT1;1启动子中的612+17这一区域直接结合，在盐胁迫条件下，对OsHKT1;1的表达发挥正调控作用，将其命名为OsMYBc。
MYB蛋白家族是植物中已知的最大的转录因子家族之一，因其共有的高度保守的MYBDNA结合域而得名。这个结合区域通常由1至4个氨基酸残基序列重复（R）组成。MYB蛋白在植物初级和次级代谢调节，种子和花卉发育，细胞识别，胁迫响应等多种生物过程中发挥作用[19]，可以通过直接或间接地调控胁迫相关基因来响应盐胁迫[20]。这些被调控的下游因素包括RD22，SOSs，PP2Cs，Pi转运蛋白，ROS清除蛋白，ABA合成蛋白，细胞扩增和角质层代谢蛋白等应激诱导蛋白。
而新发现的MYBcc家族仅占MYB家族中的一小部分，含有coiled coil保守域，可能与形成二聚体复合物相关[21]。目前有关于MYBcc转录因子的报道并不多，多见于磷元素饥饿调控相关的PHR类转录因子，以及影响开花时间的AtMyr1, AtMyr2。
为进一步了解完善HKT基因表达的调节网络，前期研究通过酵母双杂交试验，筛选到与OsMYBc互作的蛋白：RING型泛素E3连接酶，将其命名为OsMSRFP（Oryza sativa MYBcStressrelated RING Finger Protein）。在水稻中，许多RING指蛋白被证明参与对非生物胁迫的响应和适应[22]。据报道，编码泛素E3连接酶的水稻RING结构域蛋白1（OsRDCP1）和水稻叶绿体靶向RING E3连接酶1（OsCTR1）过表达时，能提高转基因植物耐旱性[23,24]。
植物适应非生物胁迫的调节系统包括转录、翻译这两大过程中的调控[25]，翻译后的调控又以泛素化修饰为代表。蛋白质的泛素化通常导致其通过26S蛋白酶体的降解[26]。泛素化修饰是一个酶联反应的过程，包括E1活化，E2偶联和E3连接。E3蛋白通常根据其结构和作用机制分为四个主要亚家族：与E6相关蛋白C终点同源（HECT），真正有趣的新基因（RING），U盒和cullinRING连接酶[27]。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.1.1植物材料 3
1.1.2菌株、载体3
1.1.3主要试剂和试剂盒 3
1.2研究方法3
1.2.1烟草瞬时表达方法3
1.2.2 GUS活性测定3
1.2.3质粒提取方法3
1.2.4 GST标签蛋白原核表达及纯化3
1.2.5免疫印迹（western blot）检测3
1.2.6点突变实验3
1.2.7双分子荧光互补BiFC3
1.2.8 GST Pull Down4
1.2.9 95体外泛素化试验4
1.2.10数据分析4
2结果与分析4
2.1OsMSRFP泛素E3连接酶活性验证4
2.2OsMSRFP定位于细胞边缘和细胞核4
2.3GST Pull Down证实OsMSRFP是OsMYBc的互作蛋白5
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MYBc和OsMSRFP存在相互关联6
2.5OsMYBc是OsMSRFP的反应底物7
2.6OsMSRFP和OsMYBc互作后对OsHKT1;1起正调控作用8
3结论与讨论9
3.1OsMYBc与OsMSRFP互作且正向调控OsHKT1;1转录9
3.2蛋白质泛素化结果讨论9
致谢10
参考文献10
水稻耐盐基因MYBc与泛素E3连接酶（OsMSRFP）互作验证及功能的初步研究
引言
植物因其固定不动的特性比动物更易受环境因素的影响[1]。盐害、水分和温度已成为全球作物的三大环境危害因素。土壤盐渍化是世界范围内面临的环境问题，全世界约8千万公顷的土地遭受盐渍化的侵蚀，中国盐渍土分布广、类型多，总面积约1亿hm2是制约农业生产的重要因素。
生理研究表明植物盐分胁迫是多因素的，包括渗透胁迫和细胞钠（Na+）毒性[3]。当植物体内的盐离子积累到一定程度，离子毒害开始显现，包括细胞膜完整性被破坏；胞内蛋白质失活影响胞内的酶反应，其中以光合过程对盐度最敏感；蛋白质合成受抑制；胞内Na+/K+平衡被打破[4]等。
虽然高盐浓度抑制植物生长，但在植物体内有一套适应或者抵御Na+积累的措施和途径，或将Na+排出细胞外至质外体或土壤中[57]，或是螯合胞质中的Na+以隔离在液泡中[8]，或是减少Na+从根部向地上部的运输，或是增强地上部Na+向地下部回流[911]。要完成这些生理过程需要Na+通道蛋白和转运载体的参与和相互配合。
最近的研究表明，HKT转运体/离子通道家族在植物Na+耐受机制中起重要作用[2]。HKT转运蛋白可以依据对Na+和K+的离子渗透性分为两类：I类HKT转运蛋白（HKT1s）通常介导Na+的选择性转运，而II类HKT转运蛋白（HKT2）部分介导Na+/K+转运活性[12,13]。拟南芥，水稻和小麦中I类HKT转运蛋白可从叶子排出Na+，从木质部汁液中除去Na+[1518]，以保护植物叶和光合机械免于Na+过度积累的危害，提高植物Na+耐受性[11,14]。
但目前尚未在植物中发现HKT转运蛋白的调节剂[2]。考虑到基因转录水平的调节对植物抵御胁迫的生理调节有重要意义，实验室团队用Clontech的酵母单杂交系统Matchmaker Gold Yeast OneHybrid Library Screening System筛选cDNA文库中与启动子区域结合的转录因子，发现MYBcc家族的蛋白可以与OsHKT1;1启动子中的612+17这一区域直接结合，在盐胁迫条件下，对OsHKT1;1的表达发挥正调控作用，将其命名为OsMYBc。
MYB蛋白家族是植物中已知的最大的转录因子家族之一，因其共有的高度保守的MYBDNA结合域而得名。这个结合区域通常由1至4个氨基酸残基序列重复（R）组成。MYB蛋白在植物初级和次级代谢调节，种子和花卉发育，细胞识别，胁迫响应等多种生物过程中发挥作用[19]，可以通过直接或间接地调控胁迫相关基因来响应盐胁迫[20]。这些被调控的下游因素包括RD22，SOSs，PP2Cs，Pi转运蛋白，ROS清除蛋白，ABA合成蛋白，细胞扩增和角质层代谢蛋白等应激诱导蛋白。
而新发现的MYBcc家族仅占MYB家族中的一小部分，含有coiled coil保守域，可能与形成二聚体复合物相关[21]。目前有关于MYBcc转录因子的报道并不多，多见于磷元素饥饿调控相关的PHR类转录因子，以及影响开花时间的AtMyr1, AtMyr2。
为进一步了解完善HKT基因表达的调节网络，前期研究通过酵母双杂交试验，筛选到与OsMYBc互作的蛋白：RING型泛素E3连接酶，将其命名为OsMSRFP（Oryza sativa MYBcStressrelated RING Finger Protein）。在水稻中，许多RING指蛋白被证明参与对非生物胁迫的响应和适应[22]。据报道，编码泛素E3连接酶的水稻RING结构域蛋白1（OsRDCP1）和水稻叶绿体靶向RING E3连接酶1（OsCTR1）过表达时，能提高转基因植物耐旱性[23,24]。
植物适应非生物胁迫的调节系统包括转录、翻译这两大过程中的调控[25]，翻译后的调控又以泛素化修饰为代表。蛋白质的泛素化通常导致其通过26S蛋白酶体的降解[26]。泛素化修饰是一个酶联反应的过程，包括E1活化，E2偶联和E3连接。E3蛋白通常根据其结构和作用机制分为四个主要亚家族：与E6相关蛋白C终点同源（HECT），真正有趣的新基因（RING），U盒和cullinRING连接酶[27]。
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