棉花wallsarethin(wat)基因家族发掘与黄萎病抗性功能的初步分析棉花wallsarethin(wat)基因家族发掘与黄萎病抗性功能的初步分析【字数：7297】
WAT基因家族在植物中普遍存在，并且在维管组织尤其是次生部分的形成中发挥着重要的作用，而棉花黄萎病是一种通过纹孔侵染邻近的导管分子的土传性真菌维管束病害。我们通过TRV病毒介导的基因沉默这一植物基因功能研究中常用的生物技术来达到沉默目的基因的目的。我们首先通构建TRV载体，通过根瘤农杆菌（GV3101）介导侵染寄主，根瘤农杆菌在宿主体内诱发VIGS。之后，对处理过的棉花材料进行接病，通过观察发病情况进行记录和分析，筛选出WAT基因家族的成员WAT1在抗棉花黄萎病中有具有重要作用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.1.1植物材料2
1.1.2实验用菌株2
1.1.3试剂与仪器2
1.1.4 常用酶与试剂盒2
1.2 实验用培养基 3
1.2.1 基本培养基3
1.2.2 农杆菌培养基3
1.2.3 黄萎病菌培养基3
1.3 实验方法 3
1.3.1基因序列的分析及获得3
1.3.2 TRV病毒载体的构建4
1.3.3棉花的种植及培养6
1.3.4 棉花接种病菌6
1.3.5棉花接病7
2 结果与分析7
2.1 VIGS体系的建立7
2.2 棉花中沉默WAT1基因后对黄萎病抗性变化的分析8
2.3 qPCR检测沉默后水杨酸相关基因表达量8
3 讨论 9
3.1 WAT1与棉花对黄萎病的抗性有关9
3.2 WAT1调节水杨酸相关基因的表达10
致谢10
参考文献10
棉花walls are thin (WAT)基因家族发掘与抗黄萎病抗性功能初步分析
引言
引言:棉花是我国重要的经济作物，并且广泛应用于我国纺织、食品、化工等各个行业，其抗病稳定性是影响种植效益的重要因素，由大丽轮枝菌（Verticillium *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
dahliae）引起的棉花黄萎病（Cotton Verticillium wilt）是影响当前棉花产量的最重要因素之一，棉花黄萎病作为一种真菌性维管束病害，它的传播主要通过土壤，棉花感染黄萎病后叶片会出现明显病变，包括叶片失绿变黄，直至萎蔫脱落，严重威胁棉花产量及纤维品质，造成严重的经济损失[1]。
目前对于棉花黄萎病感染机制的研究已经较为完善，土壤中的黄萎病病菌通过棉花根部侵染棉花，进入根部的病菌的菌丝延伸至细胞间隙，从而感染相邻的细胞。除此之外，黄萎病菌还可以迅速产生大量有活力的分生孢子，从而能够从纹孔进入导管，利用植物自身水和无机盐的运输在植物体内蔓延，在这一期间也有菌丝通过皮层进入维管束，进一步在植物体内蔓延。最终随着蒸腾作用的拉力不断蔓延至地上部分，使维管束呈现深褐色，叶片失绿萎蔫，最终整个植株萎蔫，组织坏死，逐渐死亡[2]。而棉花植株细胞壁厚度与体内的生长素水平与棉花的抗黄萎病能力有很大关系，因此与细胞壁形成的相关基因可能对于筛选抗病基因提供参考[3]。
另外有研究表明，WAT（Walls Are Thin）基因家族，可以编码一种植物特有的膜蛋白，并在植物中普遍表达，在维管组织尤其是次生部分的形成中发挥着重要的作用。并且已经有多个研究表明，WAT在抵抗多种植物维管束病害中起到重要的作用并且也参与水杨酸和色氨酸的代谢。
病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术作为目前公认有效的基因功能研究手段,TRV病毒介导的VIGS具有不需对目的基因进行全长测序、能过够在短时产生明显易关察的表型等许多优点[4]，并且在已经广泛应用在多种植物上,已通过该技术在烟草、马铃薯及番茄等植物中发现了多个与植物抗病反应相关的基因。本研究主要以陆地棉为材料，进行棉花黄萎病菌诱导的WAT响应基因的筛选，并且进行WAT家族相关基因的沉默研究。
我们首先通过转录组比对，选取黄萎病病菌诱导后差异较为明显的WAT基因家族。构建TRV载体，通过根瘤农杆菌介导侵染寄主，作为宿主的棉花材料为陆地棉TM1和新陆早50。根瘤农杆菌在宿主体内诱发VIGS之后，对处理过的棉花材料进行接病，所用黄萎病菌菌种为江苏落叶型菌系Vd8，通过观察发病情况进行记录和分析，筛选出效果明显的基因。
本研究可以为深入研究棉花抗黄萎病提供依据，并且筛选出棉花抗病候选基因用于棉花的抗病品种培育[5]。日后有望通过基因工程利用各种抗病相关基因或诱发抗病反应基因增强植物抗病性并应用于农业生产。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 植物材料
本次实验的研究对象为棉花，实验过程中使用了棉花材料为两种陆地棉（Gossypium hirsutum），分别为陆地棉TM1和新陆早50。
1．1．2 实验用菌株
质粒： PMD19 simple vector，TRV1,TRV2
大肠杆菌：DH5α
农杆菌：GV3101
1．1．3 试剂与仪器
常用试剂
抗生素（卡那霉素、利福平、氨苄等），氯化镁，氯化钙，无水乙醇，甘油等
常用仪器
AIRTECH超净工作台，高压灭菌锅，离心机，超纯水机，PCR仪等
1．1．4 常用酶与试剂盒
QuickCut 限制性内切酶 （EcoRI）
QuickCut 限制性内切酶（SmaI）
T4 DNA 连接酶
TaqDNA 聚合酶
北京鼎国DNA 胶回收试剂盒
BIOMIGA质粒小提试剂盒
1．2 实验用培养基
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.1.1植物材料2
1.1.2实验用菌株2
1.1.3试剂与仪器2
1.1.4 常用酶与试剂盒2
1.2 实验用培养基 3
1.2.1 基本培养基3
1.2.2 农杆菌培养基3
1.2.3 黄萎病菌培养基3
1.3 实验方法 3
1.3.1基因序列的分析及获得3
1.3.2 TRV病毒载体的构建4
1.3.3棉花的种植及培养6
1.3.4 棉花接种病菌6
1.3.5棉花接病7
2 结果与分析7
2.1 VIGS体系的建立7
2.2 棉花中沉默WAT1基因后对黄萎病抗性变化的分析8
2.3 qPCR检测沉默后水杨酸相关基因表达量8
3 讨论 9
3.1 WAT1与棉花对黄萎病的抗性有关9
3.2 WAT1调节水杨酸相关基因的表达10
致谢10
参考文献10
棉花walls are thin (WAT)基因家族发掘与抗黄萎病抗性功能初步分析
引言
引言:棉花是我国重要的经济作物，并且广泛应用于我国纺织、食品、化工等各个行业，其抗病稳定性是影响种植效益的重要因素，由大丽轮枝菌（Verticillium *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
dahliae）引起的棉花黄萎病（Cotton Verticillium wilt）是影响当前棉花产量的最重要因素之一，棉花黄萎病作为一种真菌性维管束病害，它的传播主要通过土壤，棉花感染黄萎病后叶片会出现明显病变，包括叶片失绿变黄，直至萎蔫脱落，严重威胁棉花产量及纤维品质，造成严重的经济损失[1]。
目前对于棉花黄萎病感染机制的研究已经较为完善，土壤中的黄萎病病菌通过棉花根部侵染棉花，进入根部的病菌的菌丝延伸至细胞间隙，从而感染相邻的细胞。除此之外，黄萎病菌还可以迅速产生大量有活力的分生孢子，从而能够从纹孔进入导管，利用植物自身水和无机盐的运输在植物体内蔓延，在这一期间也有菌丝通过皮层进入维管束，进一步在植物体内蔓延。最终随着蒸腾作用的拉力不断蔓延至地上部分，使维管束呈现深褐色，叶片失绿萎蔫，最终整个植株萎蔫，组织坏死，逐渐死亡[2]。而棉花植株细胞壁厚度与体内的生长素水平与棉花的抗黄萎病能力有很大关系，因此与细胞壁形成的相关基因可能对于筛选抗病基因提供参考[3]。
另外有研究表明，WAT（Walls Are Thin）基因家族，可以编码一种植物特有的膜蛋白，并在植物中普遍表达，在维管组织尤其是次生部分的形成中发挥着重要的作用。并且已经有多个研究表明，WAT在抵抗多种植物维管束病害中起到重要的作用并且也参与水杨酸和色氨酸的代谢。
病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术作为目前公认有效的基因功能研究手段,TRV病毒介导的VIGS具有不需对目的基因进行全长测序、能过够在短时产生明显易关察的表型等许多优点[4]，并且在已经广泛应用在多种植物上,已通过该技术在烟草、马铃薯及番茄等植物中发现了多个与植物抗病反应相关的基因。本研究主要以陆地棉为材料，进行棉花黄萎病菌诱导的WAT响应基因的筛选，并且进行WAT家族相关基因的沉默研究。
我们首先通过转录组比对，选取黄萎病病菌诱导后差异较为明显的WAT基因家族。构建TRV载体，通过根瘤农杆菌介导侵染寄主，作为宿主的棉花材料为陆地棉TM1和新陆早50。根瘤农杆菌在宿主体内诱发VIGS之后，对处理过的棉花材料进行接病，所用黄萎病菌菌种为江苏落叶型菌系Vd8，通过观察发病情况进行记录和分析，筛选出效果明显的基因。
本研究可以为深入研究棉花抗黄萎病提供依据，并且筛选出棉花抗病候选基因用于棉花的抗病品种培育[5]。日后有望通过基因工程利用各种抗病相关基因或诱发抗病反应基因增强植物抗病性并应用于农业生产。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 植物材料
本次实验的研究对象为棉花，实验过程中使用了棉花材料为两种陆地棉（Gossypium hirsutum），分别为陆地棉TM1和新陆早50。
1．1．2 实验用菌株
质粒： PMD19 simple vector，TRV1,TRV2
大肠杆菌：DH5α
农杆菌：GV3101
1．1．3 试剂与仪器
常用试剂
抗生素（卡那霉素、利福平、氨苄等），氯化镁，氯化钙，无水乙醇，甘油等
常用仪器
AIRTECH超净工作台，高压灭菌锅，离心机，超纯水机，PCR仪等
1．1．4 常用酶与试剂盒
QuickCut 限制性内切酶 （EcoRI）
QuickCut 限制性内切酶（SmaI）
T4 DNA 连接酶
TaqDNA 聚合酶
北京鼎国DNA 胶回收试剂盒
BIOMIGA质粒小提试剂盒
1．2 实验用培养基
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