mcr1差异性敏感的肺炎克雷伯杆菌噬菌体фnjs1的生物学特性及受体鉴定mcr1差异性敏感的肺炎克雷伯杆菌噬菌体фnjs1的生物学特性及受体鉴定(附件)【字数：12025】
多粘菌素被视为抵挡某些耐药菌感染的最后一道防线，但是质粒介导的粘菌素耐药基因mcr-1的发现，使人类面临日益严重的细菌耐药局面。抗生素疗法已岌岌可危，噬菌体治疗重新受到人们的关注。本课题以肺炎克雷伯杆菌A2312NM和噬菌体ФNJS1为研究对象，比较在是否含有mcr-1基因时噬菌体的噬斑大小、吸附率和裂解速率，实验发现噬菌体ФNJS1能更快裂解A2312NM(mcr-1)。为探究噬菌体作用受体，首先通过高碘酸盐和蛋白酶K处理细菌，发现经高碘酸盐处理后的细菌不容易被噬菌体吸附。由于高碘酸盐会破坏细菌脂多糖，表明噬菌体受体主要为脂多糖，与外膜蛋白关系不大。随后构建脂多糖的突变株，实验发现当wzyE缺失后，噬菌体裂解速率更快，但吸附率没有明显差别。之后，建立了转座子文库筛选噬菌体抗性突变株，实验发现当脂多糖中的wecG缺失后，噬菌体吸附率和裂解速率变慢。这些结果表明，ФNJS1其主要受体可能为核心寡糖或类脂A，其次级受体为肠杆菌共同抗原。本研究为应对耐药性细菌提供了新的思路，也为发现保守受体以及鉴定精准的靶标奠定了理论基础。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1材料 4
1.1.1 菌株 4
1.1.2 噬菌体 5
1.1.3 主要试剂 5
1.1.4 培养基 5
1.1.5 主要器材 5
1.2方法 5
1.2.1噬菌体ФNJS1的生物学特性5
1.2.2 高碘酸盐和蛋白酶K处理试验6
1.2.3构建LPS突变株6
1.2.4 建立转座子文库筛选噬菌体受体抗性插入突变株8
2 结果与分析10
2.1 噬菌体ФNJS1的生物学特性10
2.1.1 噬菌体ФNJS1的噬斑观察10
2.1.2 噬菌体ФNJS1的裂解试验10
2.1.3 噬菌体ФNJS1的吸附率试验 11
2.2 高碘酸盐和蛋白酶K的处理试验11
2.3 LPS突变株的构建12
2.3.1 目的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
片段和重组质粒的获得12
2.3.2 插入失活突变株的验证13
2.4 转座子插入突变株的筛选14
2.4.1 转座子插入突变株的裂解试验15
2.4.2 转座子插入位点的鉴定15
3 讨论15
致谢17
参考文献17
mcr1差异性敏感的肺炎克雷伯杆菌噬菌体ФNJS1的生物学特性及受体鉴定
国家生命科学与技术人才培养基地学生 贾媛棋
引言
引言
肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae，kp）属于肠杆菌科，在健康人和动物的胃肠道微生物组中天然存在。它是一种条件致病菌，能从临床上进行分离，约占全部革兰氏阴性菌感染的三分之一。其涉及肺炎、败血症、化脓性肝脓肿等危及生命的感染[1]。在肺炎克雷伯菌中，主要存在两种类型，一种是能产生超广谱的β内酰胺酶（extendedspectrum betalactamases，ESBLs），对头孢菌素等抗生素具有抗性；另一种能产生碳青霉烯酶（Carbapenemase），使其对所有的内酰胺类均具有抗性[2]。随着耐碳青霉烯的细菌的广泛出现，显著增加了对多粘菌素的依赖性，其被人们认为是最后的抗生素,最终的一道防线[3]。但在近几年，报道了在肠杆菌科中携带mcr1基因的质粒介导的多粘菌素耐药机制，且此质粒能进行水平基因转移，能进行快速传播[4]。mcr1基因编码磷酸乙醇胺（phosphoethanolamine，pEtN）转移酶，通过向脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的类脂A（lipid A）组分上的磷酸基团添加阳离子磷酸乙醇胺，这降低了细胞表面的净阴离子电荷，从而对阳离子的多粘菌素产生抗性[3]（如图1）。目前，对于那些含有mcr1以及超广谱β内酰胺酶和碳青霉烯酶抗性基因的多重耐药性肺炎克雷伯菌菌株，其造成了的越来越高的发病率和死亡率，抗生素疗法已完全不能满足于临床治疗且面临着严重的抗生素治疗危机。而由噬菌体衍生出的噬菌体疗法有望替代于抗生素疗法，Chhibber等人通过腹腔注射噬菌体来治疗由肺炎克雷伯菌引起的小鼠肺部炎症，被证实具有很大疗效[5]；也有研究通过滴鼻实验进行噬菌体治疗由KP1513感染的小鼠，与未处理的对照组相比，噬菌体处理的小鼠在肺中含有较低水平的肺炎克雷伯菌，此菌的噬菌体1513在体外和体内均具有很大的治疗效果，其有可能作为多重耐药性肺炎克雷伯菌引起的肺炎抗生素治疗的替代品[6]。而且有研究表明噬菌体和抗生素这两种抗微生物剂的组合在控制病原菌方面比单独使用更有效[7]。
图1 磷酸乙醇胺转移至lipid A的化学反应[8]
Fig.1 The chemical reaction of transfer of phosphoethanolamine to lipid A[8]
但是，目前噬菌体疗法应用于治疗肺炎克雷伯杆菌的感染并不普及，除了需要进行临床功效及安全性评估外，一个最主要的原因就是对噬菌体与多重耐药的肺炎克雷伯杆菌之间相互作用的机制并不完全了解。而在噬菌体与细菌互相作用的机制中，即噬菌体感染细菌的过程中，最初始的一步就是其能吸附并特异性与细菌表面的受体结合。噬菌体的吸附通常包括三个步骤：初始接触，可逆结合和不可逆结合[9]。第一步涉及布朗运动，扩散、流动引起的噬菌体和宿主之间的随机碰撞[10]；在可逆步骤中，噬菌体与细菌表面组分的结合是不稳定的，并且易从宿主上脱离；在不可逆步骤中，能与细菌表面特定受体不可逆结合，从而注入核酸[11]。在革兰氏阴性菌中，主要有两大类作为噬菌体受体，一是以外膜蛋白为受体，包括λ噬菌体的受体麦芽孔蛋白（LamB）[12]、T7 相关噬菌体Yepphi的受体外膜蛋白ail和OmpF[13]、T4 噬菌体的受体OmpC[14]等；一类是把LPS作为噬菌体受体，如霍乱弧菌的O抗原作为噬菌体VP4的受体，噬菌体VP4是霍乱弧菌血清群O1中的一种裂解噬菌体，它能通过结合霍乱弧菌El Tor上的O抗原来感染菌株，在对VP4感染具有抗性的天然分离株中，能从O抗原基因簇中鉴定出有突变，其负责O抗原的生物合成[15]；以及通过对鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis）和假结核耶尔森氏菌（Y. pseudotuberculosis）上核心寡糖的逐渐截短，最后仅表达具有类脂A的waaA突变体，即缺少Kdo/Ko区域，发现对噬菌体ФA1122完全具有抗性，最终证明其受体是LPS核心区域[16]等。而且噬菌体受体的鉴定方法也逐渐趋于完善，如最常用的构建转座子文库插入突变[17]、构建目的载体定点插入突变[16]等，还有研究相关疫苗病毒受体的病毒铺覆蛋白印迹技术（virus overlay protein binding assay，VOPBA）[18],以及近年来通过研究噬菌体尾丝蛋白的相关机制来研究噬菌体受体[19]等。因此，研究噬菌体及对其受体的分析，都在进一步挖掘噬菌体在生物生产技术和临床医学上的潜在价值，在协助噬菌体治疗、人类医疗等方面奠定了基础，也对于了解噬菌体宿主相互作用及噬菌体进化机制具有重要意义。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1材料 4
1.1.1 菌株 4
1.1.2 噬菌体 5
1.1.3 主要试剂 5
1.1.4 培养基 5
1.1.5 主要器材 5
1.2方法 5
1.2.1噬菌体ФNJS1的生物学特性5
1.2.2 高碘酸盐和蛋白酶K处理试验6
1.2.3构建LPS突变株6
1.2.4 建立转座子文库筛选噬菌体受体抗性插入突变株8
2 结果与分析10
2.1 噬菌体ФNJS1的生物学特性10
2.1.1 噬菌体ФNJS1的噬斑观察10
2.1.2 噬菌体ФNJS1的裂解试验10
2.1.3 噬菌体ФNJS1的吸附率试验 11
2.2 高碘酸盐和蛋白酶K的处理试验11
2.3 LPS突变株的构建12
2.3.1 目的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
片段和重组质粒的获得12
2.3.2 插入失活突变株的验证13
2.4 转座子插入突变株的筛选14
2.4.1 转座子插入突变株的裂解试验15
2.4.2 转座子插入位点的鉴定15
3 讨论15
致谢17
参考文献17
mcr1差异性敏感的肺炎克雷伯杆菌噬菌体ФNJS1的生物学特性及受体鉴定
国家生命科学与技术人才培养基地学生 贾媛棋
引言
引言
肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae，kp）属于肠杆菌科，在健康人和动物的胃肠道微生物组中天然存在。它是一种条件致病菌，能从临床上进行分离，约占全部革兰氏阴性菌感染的三分之一。其涉及肺炎、败血症、化脓性肝脓肿等危及生命的感染[1]。在肺炎克雷伯菌中，主要存在两种类型，一种是能产生超广谱的β内酰胺酶（extendedspectrum betalactamases，ESBLs），对头孢菌素等抗生素具有抗性；另一种能产生碳青霉烯酶（Carbapenemase），使其对所有的内酰胺类均具有抗性[2]。随着耐碳青霉烯的细菌的广泛出现，显著增加了对多粘菌素的依赖性，其被人们认为是最后的抗生素,最终的一道防线[3]。但在近几年，报道了在肠杆菌科中携带mcr1基因的质粒介导的多粘菌素耐药机制，且此质粒能进行水平基因转移，能进行快速传播[4]。mcr1基因编码磷酸乙醇胺（phosphoethanolamine，pEtN）转移酶，通过向脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的类脂A（lipid A）组分上的磷酸基团添加阳离子磷酸乙醇胺，这降低了细胞表面的净阴离子电荷，从而对阳离子的多粘菌素产生抗性[3]（如图1）。目前，对于那些含有mcr1以及超广谱β内酰胺酶和碳青霉烯酶抗性基因的多重耐药性肺炎克雷伯菌菌株，其造成了的越来越高的发病率和死亡率，抗生素疗法已完全不能满足于临床治疗且面临着严重的抗生素治疗危机。而由噬菌体衍生出的噬菌体疗法有望替代于抗生素疗法，Chhibber等人通过腹腔注射噬菌体来治疗由肺炎克雷伯菌引起的小鼠肺部炎症，被证实具有很大疗效[5]；也有研究通过滴鼻实验进行噬菌体治疗由KP1513感染的小鼠，与未处理的对照组相比，噬菌体处理的小鼠在肺中含有较低水平的肺炎克雷伯菌，此菌的噬菌体1513在体外和体内均具有很大的治疗效果，其有可能作为多重耐药性肺炎克雷伯菌引起的肺炎抗生素治疗的替代品[6]。而且有研究表明噬菌体和抗生素这两种抗微生物剂的组合在控制病原菌方面比单独使用更有效[7]。
图1 磷酸乙醇胺转移至lipid A的化学反应[8]
Fig.1 The chemical reaction of transfer of phosphoethanolamine to lipid A[8]
但是，目前噬菌体疗法应用于治疗肺炎克雷伯杆菌的感染并不普及，除了需要进行临床功效及安全性评估外，一个最主要的原因就是对噬菌体与多重耐药的肺炎克雷伯杆菌之间相互作用的机制并不完全了解。而在噬菌体与细菌互相作用的机制中，即噬菌体感染细菌的过程中，最初始的一步就是其能吸附并特异性与细菌表面的受体结合。噬菌体的吸附通常包括三个步骤：初始接触，可逆结合和不可逆结合[9]。第一步涉及布朗运动，扩散、流动引起的噬菌体和宿主之间的随机碰撞[10]；在可逆步骤中，噬菌体与细菌表面组分的结合是不稳定的，并且易从宿主上脱离；在不可逆步骤中，能与细菌表面特定受体不可逆结合，从而注入核酸[11]。在革兰氏阴性菌中，主要有两大类作为噬菌体受体，一是以外膜蛋白为受体，包括λ噬菌体的受体麦芽孔蛋白（LamB）[12]、T7 相关噬菌体Yepphi的受体外膜蛋白ail和OmpF[13]、T4 噬菌体的受体OmpC[14]等；一类是把LPS作为噬菌体受体，如霍乱弧菌的O抗原作为噬菌体VP4的受体，噬菌体VP4是霍乱弧菌血清群O1中的一种裂解噬菌体，它能通过结合霍乱弧菌El Tor上的O抗原来感染菌株，在对VP4感染具有抗性的天然分离株中，能从O抗原基因簇中鉴定出有突变，其负责O抗原的生物合成[15]；以及通过对鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis）和假结核耶尔森氏菌（Y. pseudotuberculosis）上核心寡糖的逐渐截短，最后仅表达具有类脂A的waaA突变体，即缺少Kdo/Ko区域，发现对噬菌体ФA1122完全具有抗性，最终证明其受体是LPS核心区域[16]等。而且噬菌体受体的鉴定方法也逐渐趋于完善，如最常用的构建转座子文库插入突变[17]、构建目的载体定点插入突变[16]等，还有研究相关疫苗病毒受体的病毒铺覆蛋白印迹技术（virus overlay protein binding assay，VOPBA）[18],以及近年来通过研究噬菌体尾丝蛋白的相关机制来研究噬菌体受体[19]等。因此，研究噬菌体及对其受体的分析，都在进一步挖掘噬菌体在生物生产技术和临床医学上的潜在价值，在协助噬菌体治疗、人类医疗等方面奠定了基础，也对于了解噬菌体宿主相互作用及噬菌体进化机制具有重要意义。
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