粘质沙雷氏菌中marc超家族基因的克隆及异源表达
：粘质沙雷氏菌Serratia marcescens是一种常见的微生物，被认为是条件致病菌。因被报道具有多重抗药性而引起人们的关注。marC家族蛋白之前被认为与抗生素耐药性相关，是抗生素的转运体。本文对实验室分离得到沙雷氏菌Serratia marcescens FS14菌株基因组中MarC超家族基因进行克隆表达的研究。从沙雷氏菌FS14的全基因组中获得marC家族的相关基因L085_03265、L085_15230和L085_17925的序列，根据基因序列设计含限制性酶切位点的引物。分别使用了pET24b、pET24b-malE-signal、pET28a、pET28a-signal四种表达载体对L085_03265、L085_15230和L085_17925在大肠杆菌中进行异源克隆表达，但都没有明显表达。我们认为该类膜蛋白可能在宿主大肠杆菌中进行异源表达困难可能是由于它们在大肠杆菌中折叠不好或者表达产物对大肠杆菌有毒性，以后考虑在其宿主菌沙雷氏菌中进行表达。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1 材料与方法4
1.1 实验材料4
1.1.1 供试材料的来源菌株4
1.1.2质粒和宿主菌4
1.1.3培养基4
1.1.4酶和试剂4
1.1.5主要仪器4
1.2 实验方法4
1.2.1沙雷氏菌marC超家族基因编码蛋白质的序列分析4
1.2.2沙雷氏菌中marC超家族基因原核重组表达质粒的构建及鉴定4
1.2.3重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达4
2 结果与分析5
2.1 L085_03265基因的克隆与编码蛋白的表达6
2.1.1 L085_03265所编码蛋白的结构特征分析6
2.1.2 L085_03265利用载体pET24b的克隆鉴定与表达6
2.1.3 L085_03265利用载体pET24bmalEsignal的克隆鉴定与表达7
2.1.4 L085_03265利用载体pET28a的克隆鉴定与表
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
达8
2.1.5 L085_03265利用载体pET28asignal的克隆鉴定与表达9
2.2 L085_15230基因的克隆与编码蛋白的表达11
2.2.1 L085_15230所编码蛋白的结构特征分析11
2.2.2 L085_15230利用载体pET24b的克隆鉴定与表达11
2.2.3 L085_15230利用载体pET24bmalEsignal的克隆鉴定与表达12
2.2.4 L085_15230利用载体pET28a的克隆鉴定与表达13
2.2.5 L085_15230利用载体pET28asignal的克隆鉴定与表达14
2.3 L085_17925基因的克隆与编码蛋白的表达15
2.3.1 L085_17925所编码蛋白的结构特征分析15
2.3.2 L085_17935利用载体pET24b的克隆鉴定与表达15
2.3.3 L085_17925利用载体pET28a的克隆鉴定与表达16
3 讨论17
致谢18
参考文献18
附录19
粘质沙雷氏菌Serratia marcescens FS14中marC超家族基因的克隆及异源表达
国家生命科学与技术基地 马铁群
引言
粘质沙雷氏菌粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens ) 又称灵杆菌，能产生灵菌红素，为肠杆菌科沙雷属革兰氏阴性细菌。粘质沙雷氏菌广泛分布于水体、土壤等环境，也是正常存在于人体中的最小细菌, 泌尿道和呼吸道是人体重要的贮菌部位，儿童的胃肠道也可贮菌。其曾一度被认为是无害的环境污染菌。直到1913年Woodward和Clarke 首次报道沙雷菌呼吸道感染(支气管扩张)。之后又相继报道了各类沙雷氏菌感染以及引起疾病的事件，如“假咯血综合征”和“红色尿布综合征”等。人们逐渐对该菌有了正确的认识。认为是条件致病菌。当机体抵抗力降低时引起感染。近年来沙雷菌是引起肠道外感染的主要病原菌，与许多医院内感染的暴发流行有关，诱发沙雷菌肺炎，败血症，输血和外科手术后感染及泌尿道感染等[1]。现在沙雷菌已成为医院获得性肺炎的主要病原体之一。近二十年来，国内关于沙雷菌的感染报道逐渐增多。由于该菌具有侵袭性，在机体免疫功能低下时能引起肺炎、败血症、脑膜炎以及各类感染，且对多种抗生素耐药,现已成为一种重要的条件致病菌[2]。
细菌抗生素耐药性机制由于抗生素的广泛以及一定程度上不合理的使用，产生了大量抗生素耐药性菌株，使得感染治疗愈加困难，超级细菌不断涌现。对细菌耐药性机制的研究也变得刻不容缓。细菌对抗生素耐药性的机制一般有3种：（1）产生酶，作用于抗生素结构位点将其降解；（2）降低细胞通透性，将抗生素阻隔在外；（3）通过外派泵机制，将进入胞内的抗生素药物主动排出[3]。
marC超家族编码蛋白为膜蛋白，序列长度一般为600700bp左右，形成的蛋白有大约200个残基。marC超家族蛋白一般有六个跨膜结构域，其作用一般被认为与物质转运和细菌抗生素耐药性相关。 marC基因家族一开始被认为与细菌的多抗生素抗性相关。早先的研究认为marC基因由阻遏蛋白MarR抑制，并由四环素激活，因而marC基因受控于marRAB操纵子。marRAB操纵子与多重抗生素胁迫、氧胁迫和有机溶剂胁迫相关[4,5]。对大肠杆菌中marC的研究发现其转录起始位点并不包括MarR结合位点，且不受水杨酸等marR激活剂的调控[6]。通过突变和载体构建进行marC的额外表达也并未发现细胞对氧化胁迫和抗生素的敏感性的变化[7]。因此对marC的功能仍存在疑问。目前关于marC的功能等相关方面的研究较少见，对其原本认为的细菌多抗生素耐药性相关的功能也存在争议。通过基因组测序和序列比对，已经获得大量marC超家族相关蛋白。
本实验拟通过对serratia sp. FS14基因组[8]中marC超家族的L085_03265、L085_15230和L085_17925基因研究。通过对L085_03265、L085_15230和L085_17925进行表达纯化获得活性蛋白，为沙雷氏菌中marC超家族蛋白的结构功能研究做铺垫。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 供试材料的来源的菌株
本实验的菌株FS14。由本实验室保存。
1.1.2质粒和宿主菌
表达载体：pET24b，pET28a，pET24bsignalmalE，pET28asignal。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1 材料与方法4
1.1 实验材料4
1.1.1 供试材料的来源菌株4
1.1.2质粒和宿主菌4
1.1.3培养基4
1.1.4酶和试剂4
1.1.5主要仪器4
1.2 实验方法4
1.2.1沙雷氏菌marC超家族基因编码蛋白质的序列分析4
1.2.2沙雷氏菌中marC超家族基因原核重组表达质粒的构建及鉴定4
1.2.3重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达4
2 结果与分析5
2.1 L085_03265基因的克隆与编码蛋白的表达6
2.1.1 L085_03265所编码蛋白的结构特征分析6
2.1.2 L085_03265利用载体pET24b的克隆鉴定与表达6
2.1.3 L085_03265利用载体pET24bmalEsignal的克隆鉴定与表达7
2.1.4 L085_03265利用载体pET28a的克隆鉴定与表
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
达8
2.1.5 L085_03265利用载体pET28asignal的克隆鉴定与表达9
2.2 L085_15230基因的克隆与编码蛋白的表达11
2.2.1 L085_15230所编码蛋白的结构特征分析11
2.2.2 L085_15230利用载体pET24b的克隆鉴定与表达11
2.2.3 L085_15230利用载体pET24bmalEsignal的克隆鉴定与表达12
2.2.4 L085_15230利用载体pET28a的克隆鉴定与表达13
2.2.5 L085_15230利用载体pET28asignal的克隆鉴定与表达14
2.3 L085_17925基因的克隆与编码蛋白的表达15
2.3.1 L085_17925所编码蛋白的结构特征分析15
2.3.2 L085_17935利用载体pET24b的克隆鉴定与表达15
2.3.3 L085_17925利用载体pET28a的克隆鉴定与表达16
3 讨论17
致谢18
参考文献18
附录19
粘质沙雷氏菌Serratia marcescens FS14中marC超家族基因的克隆及异源表达
国家生命科学与技术基地 马铁群
引言
粘质沙雷氏菌粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens ) 又称灵杆菌，能产生灵菌红素，为肠杆菌科沙雷属革兰氏阴性细菌。粘质沙雷氏菌广泛分布于水体、土壤等环境，也是正常存在于人体中的最小细菌, 泌尿道和呼吸道是人体重要的贮菌部位，儿童的胃肠道也可贮菌。其曾一度被认为是无害的环境污染菌。直到1913年Woodward和Clarke 首次报道沙雷菌呼吸道感染(支气管扩张)。之后又相继报道了各类沙雷氏菌感染以及引起疾病的事件，如“假咯血综合征”和“红色尿布综合征”等。人们逐渐对该菌有了正确的认识。认为是条件致病菌。当机体抵抗力降低时引起感染。近年来沙雷菌是引起肠道外感染的主要病原菌，与许多医院内感染的暴发流行有关，诱发沙雷菌肺炎，败血症，输血和外科手术后感染及泌尿道感染等[1]。现在沙雷菌已成为医院获得性肺炎的主要病原体之一。近二十年来，国内关于沙雷菌的感染报道逐渐增多。由于该菌具有侵袭性，在机体免疫功能低下时能引起肺炎、败血症、脑膜炎以及各类感染，且对多种抗生素耐药,现已成为一种重要的条件致病菌[2]。
细菌抗生素耐药性机制由于抗生素的广泛以及一定程度上不合理的使用，产生了大量抗生素耐药性菌株，使得感染治疗愈加困难，超级细菌不断涌现。对细菌耐药性机制的研究也变得刻不容缓。细菌对抗生素耐药性的机制一般有3种：（1）产生酶，作用于抗生素结构位点将其降解；（2）降低细胞通透性，将抗生素阻隔在外；（3）通过外派泵机制，将进入胞内的抗生素药物主动排出[3]。
marC超家族编码蛋白为膜蛋白，序列长度一般为600700bp左右，形成的蛋白有大约200个残基。marC超家族蛋白一般有六个跨膜结构域，其作用一般被认为与物质转运和细菌抗生素耐药性相关。 marC基因家族一开始被认为与细菌的多抗生素抗性相关。早先的研究认为marC基因由阻遏蛋白MarR抑制，并由四环素激活，因而marC基因受控于marRAB操纵子。marRAB操纵子与多重抗生素胁迫、氧胁迫和有机溶剂胁迫相关[4,5]。对大肠杆菌中marC的研究发现其转录起始位点并不包括MarR结合位点，且不受水杨酸等marR激活剂的调控[6]。通过突变和载体构建进行marC的额外表达也并未发现细胞对氧化胁迫和抗生素的敏感性的变化[7]。因此对marC的功能仍存在疑问。目前关于marC的功能等相关方面的研究较少见，对其原本认为的细菌多抗生素耐药性相关的功能也存在争议。通过基因组测序和序列比对，已经获得大量marC超家族相关蛋白。
本实验拟通过对serratia sp. FS14基因组[8]中marC超家族的L085_03265、L085_15230和L085_17925基因研究。通过对L085_03265、L085_15230和L085_17925进行表达纯化获得活性蛋白，为沙雷氏菌中marC超家族蛋白的结构功能研究做铺垫。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 供试材料的来源的菌株
本实验的菌株FS14。由本实验室保存。
1.1.2质粒和宿主菌
表达载体：pET24b，pET28a，pET24bsignalmalE，pET28asignal。
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