杂草稻种群耐寒性分化的分子机制研究
杂草稻种群耐寒性分化的分子机制研究[20200614172054]
摘要：低温寒害是影响水稻种植区域及产量的重要因素。具有较强环境适应能力的杂草稻中分化出良好抗寒性的种群，因此，研究杂草稻的抗寒能力对于改良水稻的耐寒性在理论与实践上均具有指导意义。ICE1基因就是一种存在于杂草稻的抗寒基因。本研究以不同地区的杂草稻为实验材料，利用冷害指数比较法检测了不同种群杂草稻抗寒性，进一步研究了ICE1基因的表达量，以阐明杂草稻耐寒性分化的分子机制。结果显示，杂草稻的抗寒性从南向北、低纬度向高纬度，呈逐渐增强的趋势。抗寒性较高的杂草稻样品，受到冷胁迫ICE1基因总表达量要明显高于抗寒性较低的样品。这表明，杂草稻抗寒性分化是由ICE1基因所控制。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:杂草稻；ICE1基因；耐寒性分化；冷害指数
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言3
1.试验材料与方法5
1.1材料 5
1.2方法 5
1.2.1 冷害指数评价5
1.2.2 总RNA提取 5
1.2.3 cDNA合成扩增5
1.2.4荧光定量PCR6
2.结果与分析7
2.1冷害指数评价结果分析7
2.2 荧光定量表达结果分析9
讨论10
致谢 11
参考文献12
杂草稻种群耐寒性分化的分子机制研究
引言
杂草稻(Oryza sativaL.),又名杂草型稻或杂草种系，是稻田中经常与栽培稻混生的一种杂草,从形态上看它们介于野生和栽培以及籼稻和粳稻之间,出穗比栽培稻早,边成熟,边落粒,成为第二年田间的杂草,故名杂草稻[1]。杂草稻对环境具有很强的适应能力,有明显的抗病、抗旱、耐低温等优良抗逆性状, 而且与水稻有较近的亲缘关系,可以作为优良的遗传资源丰富栽培稻品种日益狭窄的遗传基础,因此在水稻遗传改良中显示出很好的应用价值。
ICE1 基因的 cDNA 全长为 2046bp，其核心部分为长度为 1485bp 的开放式阅读框，它能够编码一个含有 494 个氨基酸的蛋白质，其分子量为 53.5KD。在其编码的蛋白质 C 末端，含有一个类似 MYC的碱性螺旋-环-螺旋( bHLH )区域，且与其它 bHLH 转录因子上的 bHLH 区域具有极高的同源性。所以，ICE1 基因所编码的蛋白质也是 bHLH 蛋白中的一种，在整个 bHLH 基因所编码的蛋白质家族中的编号为 bHLH116[ *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
2]。Chinnusamy[2]等研究表明 ICE1 基因是转录因子 CBF3 的一个正调节子，并且能在低温诱导中起重要作用，而 ICEI 基因在常温下是处于钝化状态的，只有在低温时才能特异地与 CBF3 的启动子相结合，诱导 CBF3 基因的表达。而后 CBF3 与到其下游目的基因启动子的 DRE 元件相结合，进而诱导 COR 的表达，达到提高植株的抗寒性的目的； ICE1 基因突变体在低温胁迫下抗寒性没有得到提高，而 ICE1 基因的过量表达则不同，它可以调节 CBF 基因的表达从而达到显著提高植株的抗寒性的目的。
关于 ICE1–CBF–COR 冷应激激活的转录级联反应信号转导通路还有待进一步研究。它涉及到到目前为止已知的冷传感器，钙和 1，4，5 三磷酸肌醇，4，5 二磷酸磷脂酰肌醇和其他磷脂第二信使，钙传感器和钙依赖型蛋白激酶，和一个有丝原活化蛋白（MAP）激酶(MAPK)级联。低温激活拟南芥 MAPK2 和其下游的 MAPK4 和MAPK6，它们对调节 CFB 基因的表达和提高植株抗冷性可能是起着重要的作用[3]。在拟南芥体内，冷应激反应过程中的 ICE1 是过磷酸化的。因此，转录级联是由ICE1 和 ICE1 类似物 bHLH 表达的蛋白所控制，而他们很可能是通过冷感应和信号转导通道蛋白的磷酸化被激活的。植株体内的生物钟限制着 CBFs 的冷诱导[4]，但是昼夜交替规律是否参与冷响应途径还有待于进一步的研究。
研究发现,冷驯化过程同时涉及依赖ABA和非依赖ABA的信号传导过程[5],但依赖ABA的具体调控机制尚未阐明.在非依赖ABA的信号转导途径中,CBF DREB脱水响应元件结合因子类基因是近年来植物冷驯化研究方面的突破性进展.该类基因受冷的诱导表达,属AP2/EREBP转录因子家族,有保守的AP2 EREBP结构域[6,7],该结构域由约58个氨基酸组成,能与DRE CRTDNA调节元件相互作用,调节启动子区域含该顺式作用元件的基因的表达,主要在低温和短日照下启动表达,使细胞表现出抗冷能力[8].超表达CBF1和CBF3能强烈诱导COR基因表达,提高植物对冷胁迫的耐受能力.ICE1基因编码1个MYB类型的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子,为组成性表达并定位在核内,受冷刺激后表达稍有增强。在冷胁迫下,它与CBF3启动子区的MYC顺式作用元件结合激活CBF3基因的表达.拟南芥ICE1突变体抑制CBF3基因的表达,进而降低许多CBF目的基因的表达,削弱了植物的寒冷耐受和冷驯化的能力.过量表达ICE1基因能提高CBF和COR基因的表达及对冷的抵抗能力.ICE1需要经过冷诱导的构型变化(可能是通过磷酸化和去磷酸化作用)调节活性从而激活下游基因的表达[9].ICE1突变体的ICE1多肽链第236位的精氨酸被组氨酸替代,可能会影响附近243和245位的丝氨酸(潜在的磷酸化和去磷酸位点)磷酸化和去磷酸,从而影响与CBF3启动子区域的MYC顺式作用元件结合,致使靶基因(CBF3)表达。[10～12]
目前绝大多数研究发现植物细胞膜系统最先受到低温伤害，由此分析可知植物细胞膜相对透性以及细胞膜上各组分的变化可以作为植物抗冷性的重要指标。研究表明[13]，膜脂相变温度与膜脂的性质和组成有关，膜脂中不饱和脂肪酸含量是控制膜相变化的重要因素。膜脂相变转换温度与膜脂脂肪酸的不饱和程度密切相关。一般抗冷水稻 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
膜脂脂肪酸的不饱和度较高，膜脂相变温度相应较低，使膜在低温下保持流动性和柔韧性，以利低温下正常功能的执行和避免膜脂固化造成膜伤害。
实验证明[14]，植物的膜脂不饱和程度与植物的抗寒能力呈正相关，膜质不饱和程度可使细胞内物质在较低温度下维持正常的生理功能，所以检验植物对低温胁迫的指标就是看不饱和脂肪酸在总脂肪酸中的比例。苏维埃、杨福愉等分别利用不同的方法都证明水稻的抗冷品种膜脂流动性大[15]；王洪春等[16] 分析水稻种子干胚膜脂脂肪酸组成得出结论：亚油酸和油酸的含量与品种的抗寒性分别呈正相关和负相关。因此，低温胁迫下，植物细胞膜系中不饱和脂肪酸含量与植物抗冷性有一定的相关关系。
植物细胞中的很多生理生化反应都能产生活性氧（reactive oxygen species,ROS）。在自然条件下，植物体内自由基含量基本保持不变，其产生和清除始终处于动态平衡状态。植物体内的主要自由基清除剂有过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)等。低温胁迫下植物体内活性氧含量大幅增加。徐志防等[17]研究表明，超氧阴离子的产生和及时被清除对保持光合电子传递和增加跨膜 ΔpH 有很重要的作用，有利于叶绿体吸收的光能得到转化和耗散，在一定程度上减轻过量光能引起的光抑制损伤。SOD、CAT、POD 等抗氧化酶和抗氧化剂，构成了植物的抗氧化系统，它们协同作用保护植物免受活性氧的伤害。大量研究表明 SOD、CAT、POD 活性与植物的抗冷性密切相关。
1. 试验材料与方法
1.1 材料
供试材料为栽培稻和杂草稻，按地区分为吉林栽培稻与杂草稻，宁夏栽培稻与杂草稻，山西栽培稻与杂草稻，山东栽培稻与杂草稻，河南栽培稻与杂草稻，安徽栽培稻与杂草稻，江西栽培稻与杂草稻，广东栽培稻和杂草稻。所有材料均经冷处理时，对3到4叶期水稻进行了低温处理，5℃处理3天，然后置于室温（20℃-30℃）恢复3天。按不同时间梯度，对各地样品进行采样，进行RNA提取，然后进行荧光定量。
1.2 方法
1.2.1 冷害指数评价
摘要：低温寒害是影响水稻种植区域及产量的重要因素。具有较强环境适应能力的杂草稻中分化出良好抗寒性的种群，因此，研究杂草稻的抗寒能力对于改良水稻的耐寒性在理论与实践上均具有指导意义。ICE1基因就是一种存在于杂草稻的抗寒基因。本研究以不同地区的杂草稻为实验材料，利用冷害指数比较法检测了不同种群杂草稻抗寒性，进一步研究了ICE1基因的表达量，以阐明杂草稻耐寒性分化的分子机制。结果显示，杂草稻的抗寒性从南向北、低纬度向高纬度，呈逐渐增强的趋势。抗寒性较高的杂草稻样品，受到冷胁迫ICE1基因总表达量要明显高于抗寒性较低的样品。这表明，杂草稻抗寒性分化是由ICE1基因所控制。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:杂草稻；ICE1基因；耐寒性分化；冷害指数
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言3
1.试验材料与方法5
1.1材料 5
1.2方法 5
1.2.1 冷害指数评价5
1.2.2 总RNA提取 5
1.2.3 cDNA合成扩增5
1.2.4荧光定量PCR6
2.结果与分析7
2.1冷害指数评价结果分析7
2.2 荧光定量表达结果分析9
讨论10
致谢 11
参考文献12
杂草稻种群耐寒性分化的分子机制研究
引言
杂草稻(Oryza sativaL.),又名杂草型稻或杂草种系，是稻田中经常与栽培稻混生的一种杂草,从形态上看它们介于野生和栽培以及籼稻和粳稻之间,出穗比栽培稻早,边成熟,边落粒,成为第二年田间的杂草,故名杂草稻[1]。杂草稻对环境具有很强的适应能力,有明显的抗病、抗旱、耐低温等优良抗逆性状, 而且与水稻有较近的亲缘关系,可以作为优良的遗传资源丰富栽培稻品种日益狭窄的遗传基础,因此在水稻遗传改良中显示出很好的应用价值。
ICE1 基因的 cDNA 全长为 2046bp，其核心部分为长度为 1485bp 的开放式阅读框，它能够编码一个含有 494 个氨基酸的蛋白质，其分子量为 53.5KD。在其编码的蛋白质 C 末端，含有一个类似 MYC的碱性螺旋-环-螺旋( bHLH )区域，且与其它 bHLH 转录因子上的 bHLH 区域具有极高的同源性。所以，ICE1 基因所编码的蛋白质也是 bHLH 蛋白中的一种，在整个 bHLH 基因所编码的蛋白质家族中的编号为 bHLH116[ *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
2]。Chinnusamy[2]等研究表明 ICE1 基因是转录因子 CBF3 的一个正调节子，并且能在低温诱导中起重要作用，而 ICEI 基因在常温下是处于钝化状态的，只有在低温时才能特异地与 CBF3 的启动子相结合，诱导 CBF3 基因的表达。而后 CBF3 与到其下游目的基因启动子的 DRE 元件相结合，进而诱导 COR 的表达，达到提高植株的抗寒性的目的； ICE1 基因突变体在低温胁迫下抗寒性没有得到提高，而 ICE1 基因的过量表达则不同，它可以调节 CBF 基因的表达从而达到显著提高植株的抗寒性的目的。
关于 ICE1–CBF–COR 冷应激激活的转录级联反应信号转导通路还有待进一步研究。它涉及到到目前为止已知的冷传感器，钙和 1，4，5 三磷酸肌醇，4，5 二磷酸磷脂酰肌醇和其他磷脂第二信使，钙传感器和钙依赖型蛋白激酶，和一个有丝原活化蛋白（MAP）激酶(MAPK)级联。低温激活拟南芥 MAPK2 和其下游的 MAPK4 和MAPK6，它们对调节 CFB 基因的表达和提高植株抗冷性可能是起着重要的作用[3]。在拟南芥体内，冷应激反应过程中的 ICE1 是过磷酸化的。因此，转录级联是由ICE1 和 ICE1 类似物 bHLH 表达的蛋白所控制，而他们很可能是通过冷感应和信号转导通道蛋白的磷酸化被激活的。植株体内的生物钟限制着 CBFs 的冷诱导[4]，但是昼夜交替规律是否参与冷响应途径还有待于进一步的研究。
研究发现,冷驯化过程同时涉及依赖ABA和非依赖ABA的信号传导过程[5],但依赖ABA的具体调控机制尚未阐明.在非依赖ABA的信号转导途径中,CBF DREB脱水响应元件结合因子类基因是近年来植物冷驯化研究方面的突破性进展.该类基因受冷的诱导表达,属AP2/EREBP转录因子家族,有保守的AP2 EREBP结构域[6,7],该结构域由约58个氨基酸组成,能与DRE CRTDNA调节元件相互作用,调节启动子区域含该顺式作用元件的基因的表达,主要在低温和短日照下启动表达,使细胞表现出抗冷能力[8].超表达CBF1和CBF3能强烈诱导COR基因表达,提高植物对冷胁迫的耐受能力.ICE1基因编码1个MYB类型的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子,为组成性表达并定位在核内,受冷刺激后表达稍有增强。在冷胁迫下,它与CBF3启动子区的MYC顺式作用元件结合激活CBF3基因的表达.拟南芥ICE1突变体抑制CBF3基因的表达,进而降低许多CBF目的基因的表达,削弱了植物的寒冷耐受和冷驯化的能力.过量表达ICE1基因能提高CBF和COR基因的表达及对冷的抵抗能力.ICE1需要经过冷诱导的构型变化(可能是通过磷酸化和去磷酸化作用)调节活性从而激活下游基因的表达[9].ICE1突变体的ICE1多肽链第236位的精氨酸被组氨酸替代,可能会影响附近243和245位的丝氨酸(潜在的磷酸化和去磷酸位点)磷酸化和去磷酸,从而影响与CBF3启动子区域的MYC顺式作用元件结合,致使靶基因(CBF3)表达。[10～12]
目前绝大多数研究发现植物细胞膜系统最先受到低温伤害，由此分析可知植物细胞膜相对透性以及细胞膜上各组分的变化可以作为植物抗冷性的重要指标。研究表明[13]，膜脂相变温度与膜脂的性质和组成有关，膜脂中不饱和脂肪酸含量是控制膜相变化的重要因素。膜脂相变转换温度与膜脂脂肪酸的不饱和程度密切相关。一般抗冷水稻 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
膜脂脂肪酸的不饱和度较高，膜脂相变温度相应较低，使膜在低温下保持流动性和柔韧性，以利低温下正常功能的执行和避免膜脂固化造成膜伤害。
实验证明[14]，植物的膜脂不饱和程度与植物的抗寒能力呈正相关，膜质不饱和程度可使细胞内物质在较低温度下维持正常的生理功能，所以检验植物对低温胁迫的指标就是看不饱和脂肪酸在总脂肪酸中的比例。苏维埃、杨福愉等分别利用不同的方法都证明水稻的抗冷品种膜脂流动性大[15]；王洪春等[16] 分析水稻种子干胚膜脂脂肪酸组成得出结论：亚油酸和油酸的含量与品种的抗寒性分别呈正相关和负相关。因此，低温胁迫下，植物细胞膜系中不饱和脂肪酸含量与植物抗冷性有一定的相关关系。
植物细胞中的很多生理生化反应都能产生活性氧（reactive oxygen species,ROS）。在自然条件下，植物体内自由基含量基本保持不变，其产生和清除始终处于动态平衡状态。植物体内的主要自由基清除剂有过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)等。低温胁迫下植物体内活性氧含量大幅增加。徐志防等[17]研究表明，超氧阴离子的产生和及时被清除对保持光合电子传递和增加跨膜 ΔpH 有很重要的作用，有利于叶绿体吸收的光能得到转化和耗散，在一定程度上减轻过量光能引起的光抑制损伤。SOD、CAT、POD 等抗氧化酶和抗氧化剂，构成了植物的抗氧化系统，它们协同作用保护植物免受活性氧的伤害。大量研究表明 SOD、CAT、POD 活性与植物的抗冷性密切相关。
1. 试验材料与方法
1.1 材料
供试材料为栽培稻和杂草稻，按地区分为吉林栽培稻与杂草稻，宁夏栽培稻与杂草稻，山西栽培稻与杂草稻，山东栽培稻与杂草稻，河南栽培稻与杂草稻，安徽栽培稻与杂草稻，江西栽培稻与杂草稻，广东栽培稻和杂草稻。所有材料均经冷处理时，对3到4叶期水稻进行了低温处理，5℃处理3天，然后置于室温（20℃-30℃）恢复3天。按不同时间梯度，对各地样品进行采样，进行RNA提取，然后进行荧光定量。
1.2 方法
1.2.1 冷害指数评价
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/swgc/smkx/484.html
